Der Tumorsuppressor Wt1 aktiviert die Transkription des Erythropoietinrezeptors in hämatopoietischen Vorläuferzellen

Abstract

Das Wilmstumorgen, Wt1, auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 (11p13) wurde ursprünglich als Tumorsuppressorgen identifiziert. Es kodiert ein Zinkfingerprotein, dessen alternative Spleißformen überwiegend als Transkriptionsfaktoren wirksam sind. Neben seiner Eigenschaft als Tumorsuppressor spielt Wt1 eine zentrale Rolle in der embryonalen Entwicklung, während der es u.a. für die Ausbildung des Urogenitalsystems, des Mesothels sowie bestimmter sensorischer Neuroepithelien erforderlich ist. Die Expression von Wt1 in CD34-positiven hämatopoietischen Vorläuferzellen deutet auf eine bislang noch unklare Funktion bei der normalen Reifung von Blutzellen hin. Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß Wt1 die Transkription des Erythropoietin (Epo) Gens in der fötalen Mausleber aktiviert. Epo fördert durch Bindung an den Epo-Rezeptor (EpoR) das Wachstum hämatopoietischer Progenitorzellen, indem es deren programmierten Zelltod (Apoptose) verhindert und die Proliferation und Differenzierung stimuliert. Die EpoR-Expression ist essentiell für die sogenannte definitive Hämatopoiese, und kann auf transkriptionaler und post-transkriptionaler Ebene sowie durch posttranslationale Modifikation reguliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese geprüft, daß die Transkription des EpoR- kodierenden Gens durch Wt1 stimuliert wird. Weiterhin wurde untersucht, ob eine verminderte EpoR-Expression bei Fehlen von Wt1 zu einem Funktionsdefizit erythroider Vorläuferzellen beiträgt. Die Versuchsergebnisse dokumentieren eine enge Korrelation der Expressionsniveaus von Wt1 und EpoR in verschiedenen Zellen hämatopoietischen und nicht-hämatopoietischen Ursprungs. Wt1-defiziente, fötale CD117+-Leberzellen der Maus enthielten im Vergleich zu Zellen von heterozygoten (Wt1+/-) und Wildtyp-Tieren (Wt1+/+) signifikant weniger EpoR- mRNA. Auch die Fähigkeit hämatopoietischer Vorläuferzellen, erythroide Kolonien auszubilden, war bei Wt1-Defizienz signifikant vermindert. Im Vergleich zu hämatopoietischen Progenitorzellen von Wt1+/+ - und Wt1+/- -Embryonen war die in vitro Proliferation Wt1-negativer CD117+-Zellen in Gegenwart von rekombinantem humanem Erythropoietin (rhEpo) signifikant reduziert. Mittels Benzidinfärbungen konnte eine signifikante Reduktion hämoglobinpositiver Zellen als Hinweis auf eine gestörte erythroide Differenzierung in den Lebern von Wt1-/- -Embryonen im Vergleich zu Wt1+/- -und Wt1+/+ -Tieren nachgewiesen werden. Durch Kombination verschiedener zell- und molekularbiologischer Arbeitstechniken (Promotor-Reporterassays, Elektrophorese Mobilitässhiftassay, Chromatinimmunpräzipitationsassay etc.) wurde ermittelt, daß die transkriptionskompetente Wt1(-KTS) -Isoform den EpoR- Promotor von Mensch und Maus in erythroleukämischen Zellen transaktiviert. Das hierfür verantwortliche cis-Element wurde in den jeweiligen Promotoren lokalisiert und identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben Wt1 als neuen transkriptionalen Aktivator des EpoR-Gens. Gemeinsam mit der in vorangegangenen Untersuchungen nachgewiesenen Transaktivierung des Epo-Gens durch Wt1 stellt die Stimulation der Transkription von EpoR einen wichtigen Signalmechanismus während der normalen Hämatopoiese dar. Mit EpoR wurde erstmalig ein Mitglied der hämatopoietischen Zytokinrezeptorsuperfamilie als Wt1-Zielgen identifiziert und eine direkte Regulation des EpoR-Gens durch Wt1(-KTS) in hämatopoietischen Vorläuferzellen nachgewiesen. Bei Fehlen von Wt1 resultiert eine Störung der normalen in vitro Differenzierung erythroider Progenitorzellen. Es bleibt abzuklären, ob eine Fehlfunktion des Epo/EpoR- Signalwegs für die Malignität von Leukämien mit hohem Wt1 Expressionsniveau mitverantwortlich ist. In Anbetracht der klinischen relevanten Bedeutung von EpoR als Vermittler neuro- und kardioprotektiver Effekte von Epo sind zusätzliche Studien erforderlich, um eine mögliche Wt1-abhängige Expressionskontrolle des EpoR-Gens in nicht-hämatopoietischen Geweben abzuklären.

Wilms’ tumor gene, Wt1, on the short arm of human chromosome 11 (11p13) was initially identified as a tumor suppressor gene. Wt1 encodes an approximately 50 kDa zinc finger protein, whose alternative splice forms function mainly as transcription factors. Besides its role as a tumor suppressor Wt1 fulfills critical functions during embryonic development and is required for normal formation of the genitourinary system, mesothelium, and certain neuronal tissues. Expression of Wt1 in CD34-positive hematopoietic progenitor cells suggested a so far not well defined role for Wt1 in blood cell maturation. Indeed, recent studies have shown that Wt1 stimulates transcription of the gene encoding erythropoietin (Epo) in fetal mouse liver. Through interaction with its cognate receptor, Epo inhibits programmed death (apoptosis) and favors the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitor cells. Expression of EpoR, which can be regulated at the transcriptional and post-transcriptional level as well as by post-transcriptional modification, is essential for definitive hematopoiesis. The purpose of this study was to examine the hypothesis that Wt1 stimulates transcription of the EpoR gene. Further on it was tested whether reduced EpoR expression would impair the normal maturation of erythroid progenitors in Wt1 deficiency. The results of this study demonstrate a close correlation between Wt1 and EpoR mRNA levels in various cell lines of hematopoietic and non-hematopoietic origin. In particular, Wt1-deficient CD117+ cells from mouse fetal liver contained lower amounts of EpoR transcripts than those obtained from heterozygous (Wt1+/-) and wild-type (Wt1+/+) embryos. The capacity of erythroid conoly formation was significantly reduced in the absence of Wt1. Likewise CD117+ cells from Wt1-deficient murine fetal liver exhibited a significantly lower in vitro proliferative response to recombinant human Epo than Wt1+/+ and Wt1+/- progenitors. Benzidine staining indicated a significant reduction of hemoglobin-positive cells in fetal liver of Wt1-/- vs. Wt1+/+ and Wt1+/- murine embryos. The combinatorial use of various cell and molecular biology techniques (promoter-reporter assay, electrophoretic mobility shift assay, chromatin immunoprecipitation assay) disclosed stimulation of the EpoR promoter from human and mouse by the transcriptionally active Wt1(-KTS) protein in erythroleukemia cells. The responsible cis-element in the human and murine EpoR promotor sequence could be identified. In conclusion, these findings demonstrate that the Wilms’ tumor gene product, Wt1, activates transcription of the EpoR gene. Along with the previously recognized transactivation of the Epo gene by Wt1 the results of this study describe a novel regulatory switch in normal hematopoiesis. Notably, EpoR is the first target gene of Wt1 among the hematopoietic cytokine receptor superfamily. Moreover, direct regulation of the EpoR gene by the Wt1(-KTS) protein in hematopoietic progenitor cell is demonstrated. Lack of Wt1 results in a failure of normal in vitro differentiation of erythroid progenitor cells. It remains to be proven whether dysfunction of the Epo/EpoR signaling pathway is responsible, at least in part, for the malignancy of human leukemias with high Wt1 expression. Considering the importance of EpoR in mediating the neuro- and cardioprotective effects of Epo, additional studies are necessary to clarify the possible of Wt1 in EpoR expression in non-hematopoietic tissues.