Untersuchung der Apoptose auslösenden und Resistenz überwindenden Eigenschaften neuartiger organometallischer Verbindungen am Beispiel eines Ferrocen-Aminosäurederivats

Abstract

Ziel: Zytostatika-Resistenz ist bei der Therapie onkologischer Erkrankungen ein besonderes Problem. Deshalb ist es sinnvoll, nach Wirkstoffen zu suchen, welche Zytostatika-Resistenz in Tumor- und Leukämiezellen überwinden und in diesen Zellen Apoptose auslösen können. Hierbei sind Metall-organische Komplexverbindungen besonders interessant. Im Rahmen dieser Dissertation sind einige neuartige organometallische Verbindungen auf ihre Wirkung untersucht worden, darunter ein Eisenkomplex, ein Titan- und ein Nickelkomplex. Insbesondere soll hier beispielhaft über das Ferrocen-Aminosäurederivat HUNI 068 berichtet werden. Methoden: Die Zellzahl wurde mithilfe eines CASY®CellCounter gemessen. Mit den DNS-Fragmentierungs- und Annexin-V/PI- Doppelfärbungs-Assays wurde Apoptose gemessen, und mit dem LDH-release-Assay bestimmten wir das Ausmaß an Nekrose. Wir stellten Zytostatika-resistente Zelllinien her, um die Fähigkeit zur Resistenzüberwindung zu prüfen. Mit Echtzeit-PCR untersuchten wir Veränderungen der Genexpression behandelter Zellen. Der Apoptose-Signalübertragungsweg wurde durch Immunoblotting und Messung des Zusammenbruchs des mitochondrialen Membranpotentials untersucht. Ergebnisse: Der Eisen-Komplex HUNI 068 hemmt die Proliferation von malignen Zellen und führt zur Induktion von Apoptose. Die Auslösung von Nekrose ist gering, und gesunde Leukozyten werden weniger stark angegriffen als Krebszellen. Der Wirkstoff überwindet Zytostatika-Resistenz gegenüber Vincristin und Daunorubicin und wirkt unabhängig von p-Glykoprotein- und Bcl-2-Überexpression. Ferner konnte eine Hochregulation des Anti-Bcl-2 Proteins Harakiri beobachtet werden. HUNI 068 induzierte Apoptose auch in primären Leukämiezellen, welche gegenüber einigen konventionellen Medikamenten eine ausgeprägte Resistenz zeigten. Die Apoptose-Induktion ist unabhängig von der CD95-Expression und assoziiert mit einer Verminderung des mitochondrialen Membranpotentials sowie einer Aktivierung von Caspase-9, was für den intrinsischen Apoptose-Signalweg über die Mitochondrien spricht. Für die untersuchten Titan- und Nickel-Komplexverbindungen konnten ebenfalls zytostatische und Apoptose induzierende Eigenschaften nachgewiesen werden. Sie wirken unabhängig von Bcl-2 und durchbrechen Zytostatika-Resistenz gegenüber Vincristin. Als Signalübertragungsweg konnte hier der extrinsische Pfad identifiziert werden. Schlussfolgerungen: Die untersuchten Metall-Komplexe überwinden verschiedene Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika in malignen Zellen. Die Induktion von Apoptose erfolgt im Falle des Eisen-Komplexes HUNI 068 über die intrinsische und im Falle der Titan- und Nickel-Komplexe über die extrinsische Apoptose-Signalkaskade.

Purpose: As resistance against cytostatic drugs is a severe problem in cancer therapy, it makes sense to search for agents, which can overcome drug resistance in tumor and leukemia cells and induce apoptosis in these cells. Metal-organic complex compounds are particularly interesting. This dissertation contains the research of some recently discovered organometalic compounds, including an iron, a titanium and a nickel complex, which have been tested for their effects on cancer cells. Special attention is paid to the ferrocene amino acid derivative HUNI 068. Methods: Cell count was determined by using a CASY®CellCounter. DNA fragmentation assay and annexin-V/PI binding assays were used to measure apoptosis, and necrosis was determined by LDH- release assay. Cell lines with resistance to cytostatic drugs were generated to test the ability to overcome drug resistance. Via real-time PCR, alterations in gene expression of treated cells were analyzed. The involved apoptosis pathway was investigated by immunoblotting and the measurement of mitochondrial membrane permeability transition. Results: The iron complex HUNI 068 inhibits proliferation of cancer cells and induces apoptosis. Induction of necrosis is low and healthy leucocytes are less affected than cancer cells. The compound overcomes drug resistance to vincristine and daunorubicin and acts independently of p-glycoprotein and Bcl-2 overexpression. Upregulation of the anti-Bcl-2 protein harakiri was seen. Also, HUNI 068 achieved acceptable effects in primary leukemia cells whereas tolerance to some common drugs was shown. Induction of apoptosis is independent of CD95 expression, but associated with a reduced mitochondrial membrane potential and activation of caspase-9, indicating the intrinsic apoptosis pathway via mitochondria. The tested titanium and nickel complex compounds also proved to have cytostatic and apoptosis inducing properties. They act independently of Bcl-2 and overcome drug resistance to vincristine. Here, the extrinsic pathway of signal transduction was identified. Conclusions: The tested metal complex compounds overcome different resistance mechanisms to cytostatic drugs in cancer cells. The iron complex HUNI 068 induces apoptosis via the intrinsic signal transduction pathway, the titanium and nickel complexes use the extrinsic apoptosis pathway.