Structural basis for dual regulation of spliceosomal helicase Brr2 by the Prp8 Jab1 domain and links to retinal disease

Abstract

The spliceosome is a very dynamic cellular ribonucleoprotein (RNP) machinery responsible for the removal of non-coding regions (introns) and ligation of coding regions (exons) during pre-mRNA maturation in eukaryotes. Throughout the splicing cycle the spliceosome undergoes major structural rearrangements, especially in the RNA-RNA interaction network. RNA helicases are considered the driving forces in the dynamic remodeling of RNA-RNA, RNA-protein and protein-protein interactions. Eight members of the superfamily 2 (SF2) of helicases are present in the spliceosome, the Ski2-like RNA helicase Brr2 being one of them. Brr2 carries out the unwinding of the U4/U6 RNA duplex that is a crucial step for the spliceosome activation. The action of Brr2 ends with the release of the U4 snRNP and thus the U6 snRNA is able to extensively base pair with U2 snRNA, whose interaction is essential for catalysis. Brr2 encounters the U4/U6 di-snRNA early, when U4/U6.U5 tri-snRNP is formed. Hence, Brr2 must be tightly regulated to ensure correct timing of spliceosome activation and disassembly. However, Brr2 does not only require inhibition to avoid premature unwinding, but also activation, because this helicase is very inefficient and has to unwind the most stable RNA duplex of the spliceosome. Two protein factors have been observed to modulate Brr2's activity, Prp8 and Snu114. Both proteins, like Brr2, are constitutive members of the U5 snRNP, but only Prp8 showed a direct effect on Brr2's activity. The detailed features of this interaction are unknown. The main goals of this thesis were to learn more about the structural basis that make this interaction possible and how Prp8 influences Brr2's activity. During my PhD thesis I produced recombinantely for the first time two fragments of human Prp8, hPrp8CTF and hPrp8Jab1/MPN. I was also able to produce most of the Retinitis pigmentosa (RP) related hPrp8Jab1/MPN mutants described in literature. For each of the produced proteins I established and optimized purification protocols. The so produced pure proteins were used for interaction studies, complex reconstitution and crystallization trials. The hBrr2HR- hPrp8Jab1/MPN complex crystals allowed me to solve the structure with good resolution (3.4 A). Based on the results of the structural and functional studies, I demonstrated how the Jab1/MPN domain of Prp8 binds to Brr2 and can inhibit RNA loading and Brr2-mediated U4/U6 snRNA unwinding by transiently inserting its C-terminal tail into Brr2's RNA binding channel. The same domain acts as a coactivator under conditions favoring RNA binding, enhancing the coupling of ATP hydrolysis to duplex unwinding. Thus, my data uncovered a unique dual-mode regulation of a SF2 helicase by a protein cofactor and revealed that its disruption of Brr2-Prp8 interaction constitutes a disease principle underlying certain forms of RP.

Das Spleißosom ist eine sehr dynamische Ribonukleoprotein (RNP)-Maschine, die für das Entfernen von nicht-kodierenden Regionen (Introns) und das Ligieren von kodierenden Regionen (Exons) während der Reifung von prä-mRNA in Eukaryoten verantwortlich ist. Während des Splei_zyklus durchläuft das Spleißosom weitreichende strukturelle Reorganisationen, besonders im RNA-RNA- Interaktionsnetzwerk. Als treibende Kraft hinter diesen dynamischen Umgestaltungen von RNA-RNA, RNA-Protein und Protein-Protein-Interaktionen werden RNA-Helikasen angenommen. Acht Mitglieder der Superfamilie-2 Helikasen (SF2) sind im Spleißosom vertreten, eine von ihnen ist die Ski2-ähnliche Helikase Brr2. Ein für die Aktivierung des Spleißosoms essentieller Schritt ist die Entwindung der U4/U6 RNA-Duplex, die von Brr2 katalysiert wird. Nach der Entwindung durch Brr2 wird das U4 snRNP vom Spleißosom losgelöst und ermöglicht die Ausbildung extensiver Basenpaarung zwischen den U2 und U6 snRNAs; diese Interaktion ist essentiell für die katalytische Aktivierung des Spleißosoms. Sie trifft bereits früh im Spleißzyklus auf ihr Substrat, nämlich beim Aufbau des U4/U6.U5 tri-snRNPs. Daher muss Brr2 strikt reguliert werden, um einen korrekten zeitlichen Ablauf von Aktivierung und Disassemblierung zu gewährleisten. Diese Regulation beinhaltet nicht nur die Inhibierung von Brr2, um eine verfrühte Entwindung zu verhindern, sondern auch eine Aktivierung, da das Enzym nur über schwache Helikase-Aktivität verfügt, jedoch den stabilsten RNA-Duplex des Spleißosoms auflösen muss. Es konnte gezeigt werden, dass die Proteine Prp8 und Snu114 die Brr2-Aktivität beeinflussen können. Beide Proteine sind, wie Brr2, konstitutive Bestandteile des U5 snRNPs, aber nur für Prp8 konnte ein direkter Effekt auf die Brr2-Aktivität nachgewiesen werden. Dennoch sind die Details dieser Interaktion unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, mehr über die strukturellen Details dieser Interaktion zu lernen, und wie Prp8 Brr2 beeinflusst. Während meiner Doktorarbeit gelang es mir erstmals zwei Prp8-Fragmente, hPrp8CTF und hPrp8Jab1/MPN, rekombinant herzustellen. Des Weiteren gelang es mir, die meisten der mit Retinitis pigmentosa in Verbindung gebrachten Mutanten von hPrp8Jab1/MPN zu produzieren. Für jedes dieser Proteine etablierte und optimierte ich Reinigungsprotokolle. Die so erhaltenen Proteine benutzte ich für Interaktionsstudien, Rekonstitution von Proteinkomplexen und Kristallisationsexperimente. Ich konnte die Struktur des hBrr2HR - hPrp8Jab1/MPN -Komplexes mit guter Auflösung (3.4 A) bestimmen. Basierend auf den Ergebnissen der strukturellen und funktionellen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Jab1/MPN-Domäne von Prp8 Brr2 bindet und RNA Bindung und Entwindung inhibiert, in dem der C-terminale Schwanz vorrübergehend in dem RNA-Bindungstunnel von Brr2 inseriert wird. Dieselbe Domäne wirkt auch als Koaktivator unter Bedingungen, die die RNA- Bindung begünstigen. Dabei wird die Kopplung von ATP-Hydrolyse und Duplex- Entwindung verstärkt. Meine Ergebnisse zeigen einen einzigartigen Regulationsmechanismus einer SF2-Helikase durch einen Protein-Kofaktor, der eine Doppelrolle als Aktivator und Inhibitor ausübt, und dass bestimmte Formen der Krankheit Retinitis pigmentosa in einer Störung der Interaktion zwischen Brr2 und Prp8 begründet sind.