Die Rolle des SNP rs2075820 bei Entstehung und Verlauf des Magenkarzinoms und seine Auswirkung auf die Funktion des NOD1-Rezeptors

Abstract

Die chronische Infektion mit Helicobacter pylori ist der stärkste Risikofaktor für das Magenkarzinom. Die Erkennung des Bakteriums erfolgt über den intrazellulär lokalisierten, mustererkennenden Rezeptor NOD1. Dieser vermittelt über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB eine Zytokinantwort, unter anderem mit Ausschüttung von IL-1β. Der SNP rs2075820 kodiert für einen Basenaustausch im NOD1-Gen. Er führt zu einem Aminosäureaustausch in der NBD-Domäne des Rezeptors. Ziel dieser retrospektiven monozentrischen Studie war es, die epidemiologische Bedeutung der Allele des SNPs rs2075820 für das Magenkarzinom zu untersuchen. In einer Überexpressionsstudie in HEK293-Zellen und in Stimulationsexperimenten an humanen Monozyten sollte die Auswirkung der rs2075820-Genotypen auf die Funktion des NOD1-Rezeptors studiert werden. 269 Magenkarzinompatienten und 188 gesunde Kontrollprobanden wurden mittels LightCycler®-PCR für den SNP rs2075820 genotypisiert und die Allel- und Genotypfrequenzen miteinander verglichen. Im Patientenkollektiv wiesen 54 % den G/G-, 38 % den G/A- und 8 % den A/A-Genotyp auf. Dies entsprach der Genotypenverteilung im Kontrollkollektiv. Bei den Patienten mit dem A/A-Genotyp wurde das Magenkarzinom in einem signifikant früheren Tumorstadium diagnostiziert als beim G/A- und beim G/G-Genotyp; die Hälfte der Träger des A/A-Genotyps wurden im UICC-Stadium I diagnostiziert, die Träger des G/A- und G/G-Genotyps nur in jeweils einem Viertel der Fälle. Patienten mit dem A/A-Genotyp wiesen zudem seltener Fernmetastasen bei Erstdiagnose auf und wurden häufiger mit primär kurativer Intention behandelt. Sie überlebten deutlich länger als solche mit den Genotypen G/A bzw. G/G. Zur funktionellen Charakterisierung des SNPs rs2075820 wurden beide Allele in HEK293-Zellen überexprimiert, eine Stimulation mit dem NOD1-spezifischen Liganden iE-DAP durchgeführt und anschließend in einem Reportergen-Assay die NF-ĸB-Aktivierung gemessen. Das A-Allel wies eine stark verminderte Liganden-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB auf. Eine Sequenzierung der eingesetzten Vektoren zeigte jedoch, dass der NOD1-Referenz Vektor, der in der Mutagenese eingesetzt wurde, an Position 1733 eine Base enthält, die von der NOD1-Referenzsequenz abweicht und zu einem Aminosäureaustausch führt. Bei den Stimulationsexperimenten an humanen Monozyten wiesen Monozyten mit dem A/A-Genotyp im Gegensatz zu Monozyten mt dem G/G-Genotyp eine abgeschwächte ligandenvermittelte IL-1β-Ausschüttung auf. Die Genotypisierungsstudie zeigte, dass weder einzelne Allele noch Genotypen des SNPs rs2075820 mit dem Magenkarzinom assoziiert sind. Jedoch erwies sich der A/A-Genotyp durch ein lokal begrenztes Tumorstadium bei Diagnosestellung und ein längeres medianes Überleben als ein prognostisch günstiger Faktor. Die funktionellen Untersuchungen weisen dabei auf eine verringerte Aktivierbarkeit des NOD1-Rezeptors bei dem A/A-Genotyp hin. Die Aussagekraft des Überexpressionsversuchs in HEK-Zellen wird hauptsächlich durch den Basenaustasch im Referenz-Vektor limitiert, die der Monozytenstimulatiosexperimente vor allem durch die Vielzahl an experimentellen Schritten und die daraus resultierenden möglichen Fehlerquellen. Weitere Experimente sind notwendig, um die Auswirkung des SNP rs2075820 auf die Funktion des NOD1-Rezeptors genauer und umfassend beschreiben zu können.

Chronic infection with H. pylori is the strongest risk factor for gastric cancer. The intracellular pattern recognition receptor NOD1 activates a cytokine response via the transcription factor NF-ĸB in response to H. pylori infection. Among others, the cytokine IL-1β is released. Aim of this retrospective single centre study was to examine the epidemiologic relevance of the non-synonymous SNP rs2075820, which leads to a glutamate (genotype G) to lysine (genotype A) substitution in the nucleotide binding domain, for gastric cancer. In an overexpression experiment in HEK293 cells and by stimulation of humane monocytes, we studied the effect of the different genotypes on the function of the NOD1 receptor. We genotyped 269 patients with gastric cancer and 188 healthy controls by quantitative PCR and compared the allele and genotype frequencies between the two groups. The genotype frequencies in patients with gastric cancer were 54 % (G/G), 38 % (G/A), and 8 % (A/A). This corresponded to the genotype frequencies determined in our healthy controls. Patient with the A/A genotype were significantly more often diagnosed at an early tumour stage compared to the G/A and G/G genotype; about 50% of the A/A genotype carriers were diagnosed in the UICC tumour stage I compared to only 25 % of the patients carrying the G/A or G/G genotype. Patients with the A/A genotype less often presented metastatic disease at the time of diagnosis and were more often treated with curative intention. Their mean survival time after diagnosis was longer than that of patients with G/G or G/A genotypes. To functionally characterise the SNP rs2075820, we overexpressed both alleles in HEK296 cells and later on stimulated these cells with the NOD1-specific ligand ieDAP. Finally, the expression of NF-ĸB was measured in a reporter gene assay. Cells expressing the A allele displayed a markedly diminished activity of NF-ĸB. In the monocyte stimulation experiment, human monocytes with the A/A genotype showed diminished ligand-induced IL-1β secretion compared to those with the G/G genotype. The genotype study showed no association between the SNP rs2075820 and the incidence of gastric cancer. However the A/A genotype was associated with a favourable prognosis with a longer median survival time and an earlier tumour stage at the time of diagnosis. The overexpression experiments indicate that the NOD1 receptor encoded by the A allele may be less activatable. However the validity of the overexpression experiments is limited , because complete sequencing of the vectors for both alleles revealed that both carry a synonymous mutation from the reference sequence which results in a leucin to proline substitution in the NOD1 protein. The monocyte simulation assay has a complex set up and is hence prone to errors. For a more precise characterisation of the effects of the rs2075820 alleles on the function of the NOD1 receptor, further studies are needed..