Untersuchungen zur Stickstoffmonoxid-Synthase-1 (NOS-1)im Skelettmuskel der Ratte unter besonderer Benutzung dercomputergestützten Bildanalyse

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde durch eine Kombination aus proteinbiochemischen, histochemischen und vor allem bildanalytischen Methoden das NOS-1/NO-System in den Skelettmuskelfasern von Ratten charakterisiert. Wesentliche Fragestellungen betrafen die Eignung der enzymhistochemischen NADPH-Diaphorase-Methode zum Nachweis der NOS-1, die Organisation des Enzyms in Costameren und seine Aktivität in den verschiedenen Typen von Skelettmuskelfasern. Desweiteren wurde die potentielle Regulation NO- sensitiver Enzyme untersucht.

In der Literatur wurde bislang eine Reihe von Inhibitoren gegen NADPH- Diaphorasen beschrieben. In dieser Arbeit wurde allerdings gezeigt, daß es nicht möglich ist, mit diesen Inhibitoren die NOS-1 enzymhistochemisch von den anderen NADPH-Diaphorasen abzugrenzen. Dagegen wurde gezeigt, daß die Zugabe chaotroper Substanzen (wie Harnstoff) zum Inkubationsmedium eine Erhöhung der Spezifität der NADPH-Diaphorasereaktion in situ für NOS-1 bewirkt, indem andere in Skelettmuskelfasern der Ratte vorkommende NADPH-Diaphorasen gehemmt werden.

Weiterhin konnte gezeigt werden, daß neben regulären auch irreguläre Costameren in Skelettmuskelfasern existieren. Irreguläre Costameren bestehen aus jeweils zwei Einzelringen, die einen regelmäßigen Abstand von 2 µm zueinander aufweisen (und somit Doppelringe bilden). Dagegen war der Abstand zwischen benachbarten irregulären Costameren äußerst unregelmäßig. Im Gegensatz zu regulären Costameren, die in 10 µm dicken Kryostatschnitten häufig zu finden sind, kommen irreguläre Costameren vorwiegend in Kryostatschnitten mit einer Dicke über 30 µm oder in gezupften Skelettmuskelfasern vor. Die irregulären Costameren ließen sich als Sarkolemminvaginationen identifizieren, die wesentlich häufiger in kontrahierten als in dilatierten Fasern auftreten. Deshalb kommen neben der NOS-1 auch andere Proteine des peripheren Cytoskeletts (z.B. Dystrophin) in irregulären Costameren vor, während intrafibrär lokalisierte Moleküle wie a-Actinin fehlen.

Es wurde ein bildanalytisches Verfahren entwickelt, mit dem die katalytischen Eigenschaften der NOS-1-Diaphorase im Skelettmuskel auf Einzelfaserebene ermittelt werden konnten. Hierbei zeigte sich, daß die NOS-1 in schnellen (Typ II-) Skelettmuskelfasern höher konzentriert ist als in langsamen (Typ I-) Fasern. Desweiteren konnte nachgewiesen werden, daß innerhalb der Gruppe der schnellen Fasern eine positive Korrelation zwischen der oxidativen Stoffwechselkapazität (bildanalytisch bestimmt durch die SDH-Reaktion) und der bildanalytisch gemessenen NOS-1-Aktivität besteht.

Außerdem konnte durch Bildanalyse gezeigt werden, daß von NO-Donatoren freigesetztes NO die Aktivität von Cytochrom-Oxidasen und GAPDH in situ hemmt. Je nach Aktivität dieser Enzyme in den verschiedenen Fasertypen vermag NO diese Fasern in unterschiedlichem Maße zu beeinflussen. Die c50% -Werte für die Cytochrom-Oxidasen waren in allen Fasertypen praktisch gleich. Sie lagen jedoch etwa um eine Größenordnung niedriger als die c50% -Werte für die GAPDH, bei denen es aber ebenfalls keine Unterschiede zwischen den Fasertypen gab.

Die Experimente dieser Arbeit erbrachten neue Details zum NOS-1/NO-System im Skelettmuskel der Ratte. Die Anwendung der Bildanalyse auf die NOS-1-spezifische NADPH-Diaphorasereaktion zeigte, daß die NOS-1 in schnellen oxidativen (FOG-) Fasern die höchste Aktivität aufweist. Dieser Fasertyp weist auch die höchsten Aktivitäten potentieller Zielenzyme für NO auf. Weitere Experimente belegten mit bildanalytischen Methoden, daß diese Enzyme in situ von NO inhibiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen somit Vorstellungen, nach denen das von der NOS-1 in Skelettmuskelfasern produzierte NO den glycolytischen und oxidativen Stoffwechsel der Muskelfasern hemmt, wodurch eine Verringerung des Energieverbrauchs des Skelettmuskels erzielt wird.

The research presented in this thesis shows how the NOS-1/NO-system of rat skeletal muscle fibers was characterized by using a combination of protein biochemical and histochemical methods with image analysis. The experiments focused its attention on the applicability of the catalytic histochemical NADPH diaphorase reaction for evidence of NOS-1, the organization of this enzyme in costameres and its catalytic activity in different types of myofibers. Further studies concentrated on the possible regulation of NO- sensitive enzymes for potential inhibiting functions of NO in myofibers.

Other researched papers have identified several inhibitors of NADPH diaphorases. In contrast to this information, the experiments undertaken as part of this study yielded that it was not possible to discriminate NOS-1 from the other NADPH diaphorases by the use of these inhibitors. Conversely, it was found that chaotropic reagents for example, urea whilst in the incubation medium exhibited a specificity of the NADPH diaphorase reaction for NOS-1 in situ, whereas other NADPH diaphorases present in rat myofibers were inhibited.

The experiments also identified that in skeletal muscle fibers both regular and irregular costameres exist. They also found, firstly, that every irregular costamere consists of two separate rings ,with a measured constant distance of 2 µm between each ring thus forming double rings. Whereas the distance between adjacent irregular costameres was found to be consistently irregular. Secondly, regular costameres were frequently found in 10 µm thick cryosections. Conversely, irregular costameres were primarily detected in cryosections with a thickness of more than 30 µm. They were alternatively found in teased myofibers. Thirdly, irregular costameres were identified as sarcolemma invaginations appearing more frequently in contracted myofibers than in dilated ones. Therefore, besides NOS-1 other proteins of the peripheral cytoskeleton (i.e. dystrophin) are found in irregular costameres.

An image-analysis based procedure was developed in order to determine the catalytic properties of NOS-1 diaphorase in skeletal muscle at the level of single myofibers. In this way, it was shown that the concentration of NOS-1 is higher in fast (type II) myofibers than in slow (type I ) ones. Furthermore it was verified that within the group of fast myofibers there is a positive correlation between the oxidative capacity (determined by image analysis of SDH reaction) and the activity of NOS-1 measured by image analysis.

It was shown also via image analysis that NO released by NO donors inhibits the activity of cytochrome oxidases and GAPDH in situ. Dependent on the basal activity of these enzymes in different fiber types, NO can distinctively influence these fiber types. The c50% values for cytochrome oxidases were similar in all fiber types. They were, however, lower by a factor of 10 than the c50% values for GAPDH which also showed no differences among the fiber types.

The experiments undertaken in this thesis identified new details of the NOS-1/NO system in rat skeletal muscles. The application of image analysis on the NOS-1-specific NADPH diaphorase reaction showed that NOS-1 is most active in fast oxidative (FOG) myofibers. At the same time, this fiber type presents highest activities of potential target enzymes of NO. Further experiments verified via image analysis that these enzymes are inhibited in situ by NO. Thus, the results of this thesis support suggestions that the NO produced by NOS-1 in myofibers downregulates the glycolytic and oxidative metabolism of myofibers with the effect of decreasing energy consumption of skeletal muscles.