Etablierung eines humanen Kokultur-Systems zwischen Plasmazellen und mesenchymalen Knochenmarkstromazellen

Abstract

Plasmazellen sind verantwortlich für die Produktion und Sekretion spezifischer Antikörper und tragen so maßgeblich zur humoralen Immunität bei. Sie durchlaufen einen Entwicklungsprozess von der B-Zelle über Plasmablasten (Plasmazellvorläufer) bis hin zur terminalen Plasmazelle. Plasmablasten aus dem peripheren Blut wandern unter anderem in das Knochenmark, wo sie zur reifen Plasmazelle ausdifferenzieren können. Eine wichtige Rolle spielen hierbei mesenchymale Knochenmarkstromazellen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein humanes Kokultur-System zwischen mesenchymalen Knochenmarkzellen und Plasmazellen etabliert. Zunächst wurden mesenchymale Stromazellen aus Knochenmarkproben gewonnen und expandiert. Es handelte sich um eine homogene nicht-hämatopoetische Population. Diese exprimieren Adhäsionsmoleküle, die für den Kontakt mit Plasmazellen wichtig sind, unter anderem CD106 (VCAM-1), CD9 und CD44. CD38++ Plasmazellvorläufer wurden mittels magnetisch-assoziierter Zellsortierung aus mononukleären Blutzellen isoliert und zur Stromazellkultur gegeben. Überleben und Differenzierung der Plasmazellen wurde im zeitlichen Verlauf in diesem Kultursystem untersucht. Zur Unterscheidung und Analyse beider Zellarten im Durchflusszytometer war es hierzu zunächst erforderlich ein spezielles FACS Setting zu etablieren. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass mesenchymale Knochenmarkstromazellen in der Lage sind, Plasmazellen für mindestens drei Tage am Leben zu erhalten. Dagegen waren ohne Beisein von stromalen Knochenmarkzellen nach diesem Zeitraum keine lebenden Plasmazellen mehr nachweisbar. Außerdem konnte auf Einzelzellebene demonstriert werden, dass in diesen Kokulturen die terminale Plasmazelldifferenzierung durch die mesenchymalen Knochenmarkstromazellen unterstützt wird. Hierzu wurde der Phänotyp von Plasmazellen anhand der Expression spezifischer Oberflächenmoleküle vor und während der Kokultur mit mesenchymalen Knochenmarkzellen verglichen. Ein Anstieg der Expression der Moleküle CD38 und CD31 deuteten auf eine zunehmende Reife der Plasmazellen hin. Es wurde gezeigt, dass die Bindung von Plasmazellen an mesenchymale Knochenmarkstromazellen ein zeitlich begrenzter Prozess ist, beim dem sich zunächst adhärente Plasmazellen im Verlauf der Kokultur wieder lösen. Andererseits konnten sich diese losgelösten Plasmazellen später wieder an die Stromazellen binden. Dies lässt auf eine transiente Interaktion zwischen beiden Zelltypen schließen. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Kokultur-Modell bietet die Möglichkeit zur Klärung klinischer relevanter Fragestellungen, z.B. inwieweit die Interaktion zwischen mesenchymalen Knochenmarkzellen und autoreaktiven Plasmazellen oder malignen Myelomzellen Resistenz dieser pathologischen Zellpopulationen gegenüber immunsuppressiver Therapie vermittelt, wie dies in der Literatur angenommen wird

Plasma cells secrete specific antibodies and are therefore very important in providing humoral immunity. In their development process plasma cell precursors (plasmablasts) derive from activated B cells and eventually differentiate into plasma cells. Peripheral blood plasmablasts are able to migrate into the bone marrow where they can differentiate into mature plasma cells. During this process mesenchymal bone marrow stromal cells (BMSC) play a remarkable role. In the present study, a human co-culture system between plasma cells and mesenchymal bone marrow stromal cells was established. At first mesenchymal stromal cells were obtained from bone marrow samples and expanded in culture. They were characterized as a homogenous, non-hematopoetic cell population, which expressed crucial adhesion molecules for a potential interaction with plasma cells such as CD106 (VCAM-1), CD9 and CD44. Plasmablasts/plasma cells were isolated from mononuclear blood cells by magnetic cell sorting (MACS) and added to the stromal cell culture. Then survival and differentiation of the plasma cells were investigated. In order to distinguish and analyze both cell types by flow cytometry it was necessary to establish a specific FACS setting. Here, it was shown that BMSC have the ability to keep plasma cells alive for at least three days. In contrast, no viable plasma cells were detectable after three days of culture without BMSC. Furthermore, it could be demonstrated at single cell level that BMSC support the terminal plasma cell differentiation during co-culture. For this, the phenotype of the plasma cells before and during co-culture with mesenchymal BMSC was compared. The increase of CD38 and CD31 expression indicated a higher maturity of the plasma cells. It was shown that there is a temporary plasma cell attachment to BMSC: once adherent plasma cells could detach during co- culture. Nevertheless these non-adherent plasma cells were able to get attached again to BMSC indicating a transient interaction between these cell types. The established co-culture system gives the opportunity to address clinically relevant questions, for example, to which extent mediates the interaction between BMSC and auto-reactive plasma cells or myeloma cells their resistance towards immunosuppression.