Regulation der Monoamin- und Glutamatspeicherung in sekretorischen Vesikeln durch die Go2alpha-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine

Abstract

In den hier vorgestellten Studien wurde die Regulation der vesikulären Monoamin- und Glutamatspeicherung durch die Go2alpha-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine untersucht. Dabei wurden einerseits die der Regulation vorgeschalteten Signale, andererseits die beeinflussten Transportparameter und mögliche Effektoren näher beleuchtet. Zusätzlich konnten für das monoaminerge System der Einfluss auf den Neurotransmittergehalt von Neuronen sowie phänotypische Auswirkungen der Deletion von Go2alpha unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen gezeigt werden. Aktivierung von Go2alpha verschiebt das chloridabhängige Transportoptimum des vesikulären Glutamattransports zu niedrigeren Chloridkonzentrationen. Dadurch kann die optimale Transportaktivität auch bei erniedrigten neuronalen Chloridkonzentrationen ermöglicht werden oder einer drohenden Hyperexzitabilität bei erhöhten zytosolischen Chloridkonzentrationen entgegengewirkt werden. Die der G-Protein vermittelten Regulation vorgeschalteten und direkt nachgeschalteten Signaltransduktionselemente bleiben jedoch unbekannt. Aktives Go2alpha inhibiert die vesikuläre Monoaminspeicherung über VMAT1 und VMAT2 in Neuronen und neuroendokrinen Zellen. Dabei ist der vesikuläre Füllungszustand das der G-Protein Aktivierung vorgeschaltete Signal. Der mittlere Teil der ersten intravesikulären Schleife von VMAT1 und VMAT2 konnte als Sensor des vesikulären Füllungszustands identifiziert werden und stellt im Fall von VMAT1 pharmakologisch eine alpha1-Rezeptor ähnliche Struktur, im Fall von VMAT2 eine 5HT1B-Rezeptor ähnliche Struktur dar. Möglicherweise übernehmen VMAT die Rolle eines G-Protein koppelnden Rezeptors in der G-Protein vermittelten Regulation der Monoaminspeicherung. Die Regulation kann als negative Feedback-Schleife zur Feinregulation des vesikulären Füllungszustands verstanden werden. Die zytosolischen Proteine CAPS1 und CAPS2 fördern die vesikuläre Monoaminspeicherung über VMAT1 und VMAT2, wie durch Überexpression in VMAT1- und VMAT2-transfizierten CHO-Zellen und an CAPS1 Deletionsmutanten gezeigt werden konnte. Die verminderte Expression von CAPS1 in Gehirnen von Go2alpha- Deletionsmutanten und die in der Literatur beschriebene Aufhebung der phänotypischen Auswirkung eines Defizits des CAPS Homolgs unc31 durch Funktionsverlust des Go-Proteins in C. elegans könnten auf CAPS1 als möglichen Effektor von Go2alpha in der Regulation der vesikulären Monoaminspeicherung hindeuten. Die physiologische Bedeutung der G-Protein vermittelten Regulation der vesikulären Neurotransmitterspeicherung wurde durch die Behandlung von Go2alpha-Deletionsmutanten mit den Psychostimulanzien Kokain und Amphetamin deutlich. In Go2alpha-Deletionsmutanten, die wiederholt mit Kokain behandelt wurden, fehlt die in Wildtyptieren vorhandene motorische Sensitivierung, was zunächst auf verminderte striatale Dopaminspiegel und veränderte Expression von Dopaminrezeptoren in Deletionsmutanten zurückgeführt wurde. Nach Amphetaminbehandlung konnte jedoch auch in Go2alpha-/- Mäusen eine motorische Sensitivierung beobachtet werden, auch wenn die motorische Aktivität der Go2alpha-/- Mäuse im Vergleich zu den Wildtypmäusen vermindert war. Verantwortlich für die unterschiedliche Wirkung von Amphetamin und Kokain auf Go2alpha-Deletionsmutanten waren Veränderungen der Expression von Proteinen (Homer1a und NR2B) in Go2alpha-Deletionsmutanten, die für das Zusammenspiel der glutamatergen und dopaminergen Signaltransduktion in striatalen Projektionsneuronen verantwortlich sind. Insgesamt konnten neue Einblicke in die Mechanismen der G-Protein vermittelten Regulation der vesikulären Neurotransmitterspeicherung gewonnen werden und am Beispiel der Speicherung der Monoamine ihre physiologische Relevanz belegt werden.

By the studies presented regulation of vesicular monoamine and glutamate storage by the Go2alpha subunit of heterotrimeric G-Proteins was investigated. In detail upstream and possible downstream signals were analyzed. For the monoaminergic system influence on neurotransmitter content and pathophysiological conditions was shown. Activation of Go2alpha shifts the chloride dependent optimum of vesicular glutamate transport to lower cytosolic chloride concentrations allowing optimal transport in presence of low cytosolic chloride concentrations and preventing hyperexcitability in presence of high cytosolic chloride concentrations. Upstream and downstream signals of G-protein mediated regulation of vesicular glutamate transport remained unknown. Active Go2alpha inhibits vesicular monoamine transport by VMAT1 and VMAT2 in neurons and neuroendocrine cells. Vesicular monoamine content was shown to be the upstream signal of G-protein activation. The central part of the first vesicular loop of VMAT1 and VMAT2 senses the vesicular monoamine content and has in case of VMAT1 alpha1-receptor like pharmacological properties, in case of VMAT2 5HT1B-receptor like properties. Possibly VMAT act as G-protein coupled receptors within this signalling pathway, which may be a negative feedback loop fine tuning vesicular monoamine content. Overexpression of VMAT1 and VMAT2 in CHO-cells and analysis of CAPS1 deletion mutants showed that CAPS1 und CAPS2 proteins promote vesicular monoamine storage via VMAT1 und VMAT2. Reduced expression of CAPS1 in Go2alpha deletion mutants and functional relations between Go proteins and the CAPS1 homologue unc31 in C. elegans indicated a possible role of CAPS1 as downstream effector in G-protein mediated regulation of monoamine storage. Treatment of Go2alpha deletion mutants with cocaine or amphetamine revealed the physiological relevance of G-protein mediated regulation of neurotransmitter storage. Cocaine induced behavioural sensitization was abolished in Go2a deletion mutants which was initially attributed to lower striatal dopamine concentrations and changes in dopamine receptor expression. Amphetamine treatment induced behavioural sensitization in both wild type mice and deletion mutants. Different effects of cocaine and amphetamine in Go2alpha deletion mutants can be explained by changes in expression of proteins (Homer1a and NR2B) involved in interaction of dopamine and glutamte induced signalling of striatal medium spiny neurons. Taken together the presented studies provided new insights in mechanisms of G-protein mediated regulation of vesicular neurotransmitter storage and its physiological relevance in the monoaminergic system.