Endothelin-System und PAF im Astrozytenzellkulturmodell

Abstract

Das Endothelin-System besteht aus drei Isopeptiden, Endothelin-1, Endothelin-2 und Endothelin-3, die an spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ETA und ETB binden. Endothelin-Converting Enzym mit seinen Isoformen (ECE-1 und ECE-2) aktiviert die inaktiven Vorstufen der Endotheline in ihre biologisch aktive Form. Astrozyten in vivo exprimieren alle Bestandteile des Endothelin-Systems bis auf ET-2. Durch die morphologische Nähe der zerebralen Blutgefäße zu Astrozyten ist der Einfluss des ET-Systems auf die von den Astrozyten gebildete Blut-Hirn-Schranke ebenso von Interesse wie der Einfluss des astrozytären ET-Systems auf die Blutflussregulation im Gehirn und vice versa. Das ET-System spielt eine Schlüsselrolle bei der Entstehung des Vasospasmus nach Subarachnoidalblutung (SAB). Bisherige Therapien des Vasospasmus mit Kalzium-Antagonisten zeigen keine signifikanten Vorteile. Jüngere Untersuchungen lassen hoffen, dass Endothelinrezeptor- und Platelet-Activating Factor (PAF)-Rezeptor-Antagonisten möglicherweise von klinischem Nutzen sind. Hinweise für eine parakrine Interaktion zwischen PAF und dem ET-System ergeben sich durch den Nachweis von PAF in der Intima und Media von vasospasti¬schen Gefäßen nach SAB. Astrozyten wurden als eine Hauptquelle der ET-Produktion nach Okklusion der A. cerebri media beschrieben. Die Wechselwirkungen zwischen vasoaktiven Faktoren im Blut, wie PAF, und dem ET-System in Astrozyten sind nicht ausreichend untersucht. Die Zusammenhänge werden verkompliziert, da Astrozyten ein eigenes PAF-Rezeptorsystem besitzen, das möglicherweise das ET- System genetisch reguliert. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle der Astrozyten bei der autokrin-parakrinen Regulation des ET-Systems auf zellulärer Ebene untersucht werden. Daher wurde das Modell der Primärkultur von Astrozyten von neugeborenen Ratten etab¬liert, um Einblicke in die genetische und zelluläre Regulation von PAF und des ET-Systems direkt in Astrozyten und unabhängig von Einflüssen über die Blut-Hirn-Schranke und anderen Zellsystemen gewinnen zu können. Es wurde der Einfluss von DBcAMP und der vasoaktiven Faktoren PAF und Thrombin auf die Regulation von Komponenten des ET-Systems vor dem Hintergrund ihrer pathophysiologischen Bedeutung bei Vasospasmus nach SAB genauer betrachtet. Es konnte gezeigt werden, dass das etablierte Astrozytenzellkulturmodell wesentliche Komponenten des ET-Systems exprimiert, insbesondere ET-1, ET-3, ECE und ETB-Rezeptoren. Die Stimulation der Zellen mit PAF führte zur Erhöhung der ET-1-mRNA-Expression. Das vorliegende Vorhaben trägt zum besseren Verständnis bei, wie PAF und das ET- System auf genetischer und zellulärer Ebene in Astrozyten reguliert werden und interagieren. Das Projekt hat möglicherweise Implikationen für die Therapie von zerebraler Ischämie und Vasospasmus nach SAB mit ET-Rezeptor- und PAFR- Antagonisten.

The Endothelin-System consists of three isopeptides, Endothelin-1, Endothelin-2 and Endothelin-3, which bind to specific G-protein coupled receptors ETA and ETB. The Endothelin-converting Enzyme with its two isoforms ECE-1 and ECE-2 cleave the inactive precursor of the Endothelin peptides to their biological active form. Astrocytes in vivo express all the components of the Endothelin-System except ET-2. Due to the close morphological relationship of astrocytes to the cerebral vasculatur the influence of the ET-system on the blood-brain-barrier, which is formed by astrocytes, and on the regulation of the cerebral blood flow and vice versa is of great interest. The ET-system plays a key role in the development of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage (SAH). Previous therapeutic approaches using Calcium antagonists to prevent vasospasm have shown no significant advantages. Recent studies indicate that ET receptor antagonists and Platelet-activating factor (PAF) receptor antagonists may offer a promising clinical approach. Detection of PAF in the Intima and Media of vasospastic vessels after SAH point to a paracrine interaction between PAF and the ET-system. Astrocytes were shown to be the main source of ET production after occlusion of the middle cerebral artery. The interaction of vasoactive factors like PAF and the ET-system in astrocytes have not been studied sufficiently. The situation is complicated by the expression of an astrocytic PAF receptor system that could regulate the ET- system on a genetic level. The aim of this presenting thesis was to study the role of astrocytes on the autokrine-paracrine regulation of the ET-system on a cellular level. Therefore, a model of primary cultures of rat astrocytes derived from new born rats was established to gain insight into the genetic and cellular regulation of PAF and the ET-system in astrocytes in the absence of the context of the blood brain barrier and other cell systems. The work focuses at the influence of DBcAMP and the vasoactive factors PAF and Thrombin on the regulation of components of the ET-system with regard to their pathophysiological relevance in vasospasm after SAH. The results presented in this work show that primary rat astrocytes of the established cell culture model express essential components of the ET-system, namely ET-1, ET-3, ECE and ETB-receptors. Stimulation of astrocytes with PAF resulted in an increased ET-1 mRNA expression. The project adds to a better understanding of how PAF and the ET-system are regulated and interact on a genetic and cellular level. The results may have implications on the therapy of cerebral ischemia and vasospasm after SAH using ET-receptor and PAF receptor antagonists.