The shuttle mechanism of the electron transport by the ruthenium(II) bipyridyl complex-modified bovine adrenodoxin in the steroid hydroxylase: Crystal structure and intramolecular electron transfer

Abstract

The main aim of the present doctoral work was to show that Adx can be photoreduced without presence of AR, and hence, to probe the "shuttle" mechanism. In order to achieve the aim, the truncated form of Adx, Adx(1-108), was covalently modified with Ru(bpy)2(mbpy). Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108) was characterized by X-ray crystallography, biophysical and biochemical methods. Possible electron-transfer pathways within the covalent 1:1 Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108) complex were predicted. Photoreduction of the [2Fe- 2S] cluster of adrenodoxin was confirmed by EPR measurements. The electron- transfer rate is concentration dependent and indicates that intermolecular electron transfer takes place. The monomolecular intramolecular rate was derived at zero concentration of the Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108) complex. Comparative investigation of the covalent 1:1 Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108) complex with the wild-type Adx and unmodified Adx(1-108) showed that, in general, reduction of Adx, one-electron carrier, is accompanied by a transfer of two electrons. However, spin quantification of the reduced [2Fe-2S] cluster indicated that only one of two irons is in Fe2+ state. At present, there is no clear explanation for this unusual feature and it needs further investigation. In general, the combination of theory and present experimental data provides a basis for further investigations of the mechanism of the electron transfer in the P450-system.

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war, mittels einer Photoreduktion des Adrenodoxins zu zeigen, dass das Eisen-Schwefel-Protein ohne Adrenodoxinreduktase reduziert und damit das Shuttle-Modell für Adrenodoxin überprüft werden kann. Um dieses Hauptziel zu erreichen, wurde eine verkürzte Form des Adrenodoxins, Adx(1-108), mit dem Ru(bpy)2(mbpy)-Komplex kovalent modifiziert. Ru(bpy)2(mbpy)-modifiziertes Adx(1-108) wurde mittels Röntgenstrukturanalyse, biophysikalischer und biochemischer Methoden untersucht. Anhand der Struktur des 1:1 Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108)-Komplexes wurden mögliche Elektronentransferwege innerhalb des Komplexes vorgeschlagen. Photoreduktion des Eisen-Schwefel-Zentrums des Adrenodoxins wurde anhand von EPR-Messungen nachgewiesen. Die Elektronentransferrate ist konzentrationsabhängig und zeigt, dass intermolekulare Elektronenübertragung stattfindet. Die intramolekulare Rate wurde bei unendlicher Verdünnung des Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108)-Komplexes berechnet. Bei der vergleichenden Untersuchung des 1:1 Ru(bpy)2(mbpy)-Adx(1-108)-Komplexes mit dem Wildtyp- Adrenodoxin und freiem Adx(1-108) wurde festgestellt, dass Adrenodoxin als Ein-Elektrontransferprotein eine Tendenz zeigt, bei Übertragung von zwei Elektronen reduziert zu werden, obwohl die Spinquantifizierung deutlich zeigt, dass nur ein Eisenatom den Fe2+-Zustand einnimmt. Die Ursache für das ungewöhnliche Verhalten des Proteins ist unklar und muss weiter untersucht werden. Die Kombination der theoretischen Kenntnisse mit experimentellen Daten erlaubt einen Einblick in den Mechanismus des Elektronentransports im P450-System. Damit wurde die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zum Elektronentransport im Cytochrom P450-System geschaffen.