Clozapine induced agranulocytosis: evidence for an immun-mediated mechanism from a patient-specific in vitro approach

Abstract

Abstract Clozapine (CZP), an atypical antipsychotic is a first choice medication in treatment of therapie- resistant schizophrenia, but its use is compromised by the risk of potentially life threatening agranulocytosis/granulocytopenia (CIAG). In statistics the incidence for suffering this serious adverse drug reaction ranges between 3 % for milder cases of granulocytopenia ( granulocytes >500/nl and < 1500/nl ) and 0,8 % for agranulocytosis (< 500 granulocytes/nl). At present the molecular mechanisms of CIAG are widely unknown, but multiple studies suspected interactions between the immune system and the side effects of clozapine. Furthermore there is no functional test or biomarker available to detect a patient specific risk for development CIAG under CZP treatment. We hypothesized an immunogenic and potentially haptene-based mechanism underlying CIAG pathophysiology and established a simple and personalized cell culture-based strategy to find a hint for our considerations. A total of 24 individuals were included in our study, six of which with a history of CIAG, six patients under CZP treatment (without CIAG) and twelve matched healthy controls. From each individual peripheral blood-derived mononuclear cells (PBMC) were separated, cultivated in a traditional lymphocyte stimulation assay and particularly exposed to CZP in different concentrations. After incubation, proliferation of PBMC was measured by a colorimetric assay and analyzed as stimulation index in relation to unstimulated cells and untreated cells. Our results revealed that in vitro CZP exposure at low levels resulted in significantly increased proliferation rates, but only in PBMC cell cultures of CIAG patients, not in the other groups. Other parameters that were examined included direct toxicity effects of CZP to PBMC cell cultures, the mitogen-induced proliferation and the effects of CZP on mitogen induced proliferation, did not significantly differ between CIAG patients and the other groups. However, the most important finding, the increased CZP-induced proliferation rate in the PBMC of CIAG patients supports our assumption of an immunogenic response, caused by CZP acting as an haptene. This personalized approach was neither designed to characterize the proliferating fraction of cells, nor to identify the risk of a patient prior to any contact with CZP. Nevertheless it may still be a starting point for additional studies to that issues and putative immunogenic mechanisms underlying CIAG development. Particularly with regard to the intention of development a predictive test, detecting the patient - specific risk of CIAG, our findings might contribute to improve the safety of CZP medication in the future.

Zusammenfassung Clozapin (CZP), ein atypisches Antipsychotikum, ist ein Medikament der ersten Wahl bei der Behandlung der therapieresistenten Schizophrenie. Aufgrund der seltenen, aber potentiell lebensbedrohlichen Agranulozytose beziehungsweise Granulozytopenie, die unter der Behandlung mit CZP auftreten kann (CIAG, clozapine-induced agranulocytosis/granulocytopenia), ist der Einsatz dennoch zurückhaltend. Die Inzidenz der CIAG liegt zwischen 3 % für eine Granulozytopenie (Granulozyten < 1500/nl und > 500/nl) und 0,8 % für die Agranulozytose (< 500 Granulozyten/nl). Derzeit sind die molekularen Ursachen der CIAG zwar noch weitestgehend unbekannt, jedoch gibt es zahlreiche Studien, die Interaktionen zwischen dem Immunsystem und den Nebenwirkungen von CZP vermuten. Zudem gibt es keine funktionellen Tests oder Biomarker, die das patientenspezifische Risiko, eine CIAG unter der Behandlung mit CZP zu entwickeln, detektieren könnten. Wir nahmen an, dass der CIAG ein immunogener und möglicherweise Hapten-basierter Mechanismus zugrunde liegt und nutzten personalisierte Zellkulturen um unsere Hypothese zu unterstützen. In unsere Studie schlossen wir insgesamt 24 Individuen ein: sechs Patienten, die in der Vergangenheit von einer CIAG betroffen waren, sechs Patienten unter Clozapintherapie, die keine CIAG entwickelten und zwölf gesunde Kontrollpersonen. Von jedem Individuum wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) separiert, in einem Lymphozyten Stimulations - Assay kultiviert und teilweise mit CZP unterschiedlicher Konzentrationen versetzt. Nach Inkubation wurde die Proliferation der PBMC mit einem colorimetrischen Test gemessen und der Stimulationsindex in Relation zu unstimulierten Zellen und unbehandelten Zellen berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass eine in-vitro Exposition der Zellen mit niedrigen Konzentrationen von CZP zu einer signifikant erhöhten Proliferationsrate der PBMC derjenigen Patienten führte, die von einer CIAG betroffen waren, nicht jedoch in den anderen Gruppen. Bei der Toxizität von CZP auf die PBMC, der Mitogen-induzierten Proliferation sowie den Effekten von CZP auf die Mitogen-induzierte Proliferation zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den CIAG Patienten und den anderen beiden Gruppen. Die wichtigste Erkenntnis, die durch CZP induzierte und gesteigerte Proliferationsrate der PBMC in der Gruppe der CIAG Patienten unterstützt unsere Annahme einer immunogenen und möglicherweise Hapten-vermittelten Reaktion. Dieser personalisierte Ansatz war weder für die Charakterisierung der proliferierenden Zellfraktionen, noch für die Einschätzung des Risikos einer CIAG bei Erstkontakt mit CZP konzipiert. Dennoch könnte es ein Ausgangspunkt für zusätzliche Studien zu diesen Aspekten und einer potentiell immunogenen Pathogenese der CIAG sein. Insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung eines prädikativen Tests, der das patientenspezifische Risiko einer CIAG erkennen kann, könnten unsere Ergebnisse in der Zukunft vielleicht einen Beitrag zur Verbesserung der Patientensicherheit leisten.