Sicherheitsnachweis zum Ausschluss einer systemischen Genexpression nach lokaler Applikation wachstumsfaktor-spezifischer Plasmide am Kaninchenmodell: molekularbiologische Untersuchung

Abstract

Der weltweit zunehmende endoprothetische Gelenkersatz hat die Lebensqualität vieler Patienten verbessert, wobei die aseptische Lockerung der Implantate die häufigste Komplikation darstellt. Die resultierenden aufwendigen Wechseloperationen gehen einher mit erhöhten Komplikations- und Mortalitätsraten. Ein experimenteller Therapieansatz zur Verbesserung der Osteointegration ist die Applikation osteoinduktiver Wachstumsfaktoren wie dem seit 2002 für die Frakturbehandlung klinisch zugelassenen BMP-2. Geringe Bioverfügbarkeiten, kurze Halbwertszeiten, hohe Kosten und dosisabhängige Nebenwirkungen begrenzen jedoch seine Einsatzmöglichkeiten. Ein neuartiger Therapieansatz ist der non-virale Gentransfer von BMP-2 mittels polymerbasierten Vektorsystem (Copolymer-Protected Gene Vectors, COPROGs), um eine lokale und zeitlich limitierte Expression des therapeutischen Proteins zu erreichen. Hierzu wird eine Plasmid-DNA mit Polyethylenimin komplexiert und von einem Schutzpolymer ummantelt. In einer tierexperimentellen Studie wurde die Effizienz und Sicherheit dieses Vektorsystems nach intramedullärer Applikation mit einer Fibrinmatrix und einem Titanelastischen Nagel in die Tibia beidseits im Kaninchenmodell untersucht. Drei Gruppen (n=16/Gruppe) wurden biomechanisch und histomorphometrisch analysiert. Die vierte Gruppe (n=12) war Gegenstand der vorliegenden Arbeit mit dem Ziel, die lokale Transfektionseffizienz und systemische Transfektion zu beurteilen. Hierzu wurde anstelle des BMP-2- ein Luciferase-Plasmid als Reportergen verwendet. Nach 4, 7 und 28 Tagen (n=4/Tag) wurden mittels PCR und qRT-PCR die lokale Transfektionseffizienz in beiden Tibiae sowie die systemische Transfektion in applikationsfernen Organproben analysiert. Blut- und Serum-Analysen sowie Röntgenuntersuchungen der Tibiae postoperativ und post mortem waren unauffällig. Die Daten zeigten eine effiziente lokale Transfektion in allen Bereichen der Tibia beidseits. Mittels PCR wurde in 22/24 und mittels qRT-PCR in 19/24 Tibiaproben eine Luciferase-Expression nachgewiesen, mit höchster Expression nach 28 Tagen. Jedoch wurde auch eine systemische Luciferase- Expression detektiert - mittels PCR in 22/88 und mittels qRT-PCR in 16/88 applikationsfernen Proben. Alle untersuchten Organe waren betroffen, initial mehr als nach 28 Tagen, am häufigsten Humerus, Lunge und Leber, jedoch mit relativ geringer Luciferase-Expression im Vergleich zum Applikationsgebiet (Tibia). Somit konnte mit dieser Sicherheitsstudie eine systemische Verteilung der Plasmide nachgewiesen werden, welche möglicherweise durch die Erhöhung des intramedullären Druckes während der Implantation des Nagels und die damit verbundene venöse Verteilung zu Stande kam. Hingegen gelang der lokale Gentransfer mittels COPROGs als Beschichtung eines intramedullären Kraftträgers in einer anderen Studie ohne systemischen Genexpressionsnachweis. Demnach scheint die systemische Transfektion von der Applikationsmethode abhängig zu sein. Einflüsse der Applikationsdosis und Fibrinogenkomponente der Fibrinmatrix sind nicht auszuschließen. Die parallel durchgeführten biomechanischen und histomorphometrischen Analysen zur Effektivität dieses non-viralen BMP-2-Gentransfers konnten allerdings keine Verbesserung der Osteointegration zeigen. Diese Erkenntnisse bedürfen weiterer Forschung, um zukünftig eine effiziente und sichere Transfektion mit COPROGs zu ermöglichen.

Worldwide expanding joint replacement has improved patient’s quality of life but the most common complication is aseptic implant loosening. Resulting complex revisions are accompanied by higher morbidity and mortality rates. Application of osteoinductive growth factors like BMP-2 (clinically approved for fracture healing since 2002) is an experimental therapy approach to improve osseointegration. Practical applicability is limited by poor bioavailability, short half-lives, high costs and dose-dependent systemic side effects. Non-viral gene transfer of BMP-2 via a polymer-based vector system (Copolymer-Protected Gene Vectors, COPROGs) is a novel therapy approach to achieve a temporary and locally expression of the therapeutic protein. Therefor plasmid-DNA is complexed with polyethyleneimine and coated by protective polymers. A rabbit-based study was performed to determine the efficiency and safety of this new vector system using a fibrin matrix for local intramedullary application and bilateral implantation of titanium tibia nails. Three groups (n=16/group) served for biomechanical and histomorphometrical tests. Subject of this present thesis was group four (n=12) to determine both local transfection efficiency and systemic distribution respectively safety. A luciferase-plasmid was used as reporter gene instead of BMP-2. The local transfection efficiency in both tibiae and systemic transfection in heterotopic organ samples were analyzed by PCR and qRT-PCR (after 4, 7, 28 days, n=4/day). Additional blood analyzes, postoperative and post-mortem tibia X-ray examinations were unobtrusive. An efficient local transfection in the whole tibia was shown bilaterally. In 22/24 tibia samples Luciferase-expression was determined by PCR and in 19/24 by qRT-PCR with highest expression after 28 days. However, a systemic Luciferase-expression was detected, too - in 22/88 heterotopic samples by PCR and in 16/88 by qRT-PCR. All examined organs were affected, the most humerus, lung and liver, but showing lower Luciferase-expression than the target (tibiae) and expression was decreasing over time. Thus, a systemic distribution of plasmids was demonstrated with this safety study. This might result from increased pressure conditions intramedullary during nail implantation with consecutive venous distribution. Whereas in another study, local gene transfer using COPROGs-coated intramedullary devices succeeded without systemic gene expression. The systemic transfection seems to depend on types of application and influences through dosage and fibrinogen component of fibrin matrix cannot be excluded. Moreover neither biomechanical nor histomorphometrical tests to evaluate efficiency could show an increased osseointegration using this specific non-viral BMP-2 gene transfer via COPROGs. Thus, more investigation needs to be performed to allow a safe and efficient transfection with COPROGs.