dc.contributor.author
Dahlmann, Mathias
dc.date.accessioned
2018-06-07T14:35:32Z
dc.date.available
2009-03-23T14:19:30.354Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/112
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4316
dc.description
1\. Einleitung 7 1.1. Genexpression 7 1.2. Prozessierung der prä-mRNS 7 1.2.1.
Modifikationen am 5'- und am 3'-Ende 7 1.2.2. Modifikation durch Splicing 8
1.2.3. prä-mRNS Splicing 9 1.2.4. Aufbau und Reaktionszyklus des Spliceosoms
10 1.2.5. Regulation des Splicings in der Meiose 11 1.2.6. prä-mRNS Retention
und NMD 12 1.3. Ubiquitin und das Ubiquitin-Proteasomsystem 13 1.4. Ubiquitin-
ähnliche Proteine 15 1.4.1. Interferon-Stimulated Gene-15 16 1.4.2. Neural
Precursor Cell-Expressed Developmentally Downregulated-8 16 1.4.3. Small
Ubiquitin-Related Modifier 17 1.4.4. Ubiquitin-Fold Modifier-1 17 1.4.5. Atg8
und Atg12 18 1.4.6. Ubiquitin-Related Modifier-1 18 1.4.7. Ubiquitin-Like
Protein-5 / Homologous to Ubiquitin 1 19 1.5. Ziele dieser Arbeit 20 2\.
Ergebnisse 21 2.1. Genetische Interaktion von Hub1 mit einer Prp8-Mutante 21
2.1.1. Suche nach Genen mit synthetischer Letalität 21 2.1.2.
Charakterisierung der Prp8-Mutante 22 2.2. Interaktion mit dem Splicing-Faktor
Snu66 25 2.2.1. Interaktion von Hub1 und Snu66 25 2.2.2. Letalität der
Überexpression eines N-terminalen Snu66-Fragments 26 2.3. Einfluss von Δhub1
und prp8(P1384L) auf das Splicing 27 2.3.1. Genetische Interaktionen von Hub1
mit Faktoren des ersten Splicing-Schritts 27 2.3.2. Splicing von veränderten
Konsensussequenzen: Kupfersensitivität 30 2.3.3. Splicing von veränderten
Konsensussequenzen: β-Galaktosidaseaktivität 32 2.3.4. Splicing von
veränderten Konsensussequenzen: RT-PCR 33 2.4. Einfluss von Δhub1 auf die prä-
mRNS-Retention 34 2.4.1. Genetische Interaktion von Hub1 mit Faktoren des RES
35 2.4.2. prä-mRNS-Retention: Kupfersensitivität und β-Galaktosidaseaktivität
35 2.5. Störung der Hub1-Funktion durch C-terminale Verlängerung 37 2.6.
Charakterisierung funktionaler Aminosäurereste von Hub1 39 2.6.1. Mutagenese
von Hub1 und Selektion funktionsloser Mutanten 40 2.6.2. Expressionsgrad und
Stabilität der Hub1-Mutanten 41 2.6.3. Interaktion der Hub1-Mutanten mit Snu66
43 2.6.4. Funktionstest der Mutanten durch genetische Interaktion 46 3\.
Auswertung 49 3.1. Synthetische Letalität nach EMS-Mutagenese 49 3.2. Die
Mutation P1384L in Prp8 49 3.3. Einfluss von Δhub1 auf die prä-mRNS-
Prozessierung 52 3.3.1. Genetische Interaktionen 52 3.3.2. prä-mRNS-Retention
53 3.4. Charakterisierung der Hub1-Mutanten 54 3.5. Ausblick 58 4\. Material
und Methoden 59 4.1. Stämme, Plasmide und Oligonukleotide 59 4.1.1.
Bakterienstämme 59 4.1.2. Hefestämme 59 4.1.3. Plasmide 61 4.1.4.
Oligonukleotide 62 4.2. Molekularbiologische Methoden 64 4.2.1. Allgemeine
Methoden 64 4.2.2. Klassische Klonierung 64 4.2.3. Gateway®-System 64 4.2.4.
SDS-PAGE / Western Blot / Immundetektion 65 4.3. E. coli-Methoden 65 4.3.1.
Medien 65 4.3.2. Elektrokompetente Zellen und DNS-Transformation 65 4.3.3.
Plasmidpräparation 66 4.3.4. Proteinexpression 66 4.4. Hefe-Methoden 66 4.4.1.
Medien 66 4.4.2. Kreuzen, Sporulation und Tetradenanalyse 67 4.4.3. Tüpfeltest
zur Wachstumsanalyse 68 4.4.4. Kompetente Zellen und DNS-Transformation 68
4.4.5. Präparation von genomischer DNS / Plasmiden 68 4.4.6. Präparation von
RNS 69 4.4.7. Lyse von Hefezellen 69 4.5. Suche nach genetischen Interaktionen
mit Hub1 69 4.5.1. Mutagenese der Zellen 69 4.5.2. Suche nach
komplementierenden genomischen Fragmenten 70 4.5.3. Bestimmung der Mutation in
genomischer DNA 70 4.5.4. Suche nach genetischen Interaktionen von
Deletionsstämmen 70 4.6. Wachstumskurve 71 4.7. Reverse-Transkriptase (RT) –
PCR 71 4.7.1. DNS-Verdau und RT-Reaktion 71 4.7.2. PCR nach RT-Reaktion: 71
4.8. Wachstum auf Kupferplatten 71 4.9. β-Galaktosidase-Assay 72 4.10. N- und
C-terminale Erweiterungen von Hub1 73 4.11. Mutagenese von HUB1 und
Charakterisierung der Mutanten 73 4.11.1. Mutagenese und Isolation der
Mutanten 73 4.11.2. Vergleich der zellulären Hub1-Proteinlevel 74 4.11.3.
Vergleich der Hub1-Halbwertszeiten 74 4.11.4. Bindung der Mutanten an Snu66 im
Two-Hybrid-System 75 4.11.5. in-vitro Bindung der Mutanten an Snu66(1-107) 75
4.11.6. Komplementation der genetischen Interaktionen 76 5\.
Literaturverzeichnis 77 6\. Anhang 94 6.1. Abkürzungen 94 6.2. Erklärung 95
6.3. Danksagung 95
dc.description.abstract
Die Steuerung biochemischer Reaktionen und die Lokalisierung von Proteinen
erfolgt in der Zelle oft über Signalmoleküle. Neben Phosphorylierung,
Methylierung und Acetylierung von Ami nosäureresten, werden zelluläre
Prozesse durch eine Modifikation der beteiligten Faktoren mit Ubiquitin oder
Ubiquitin-ähnlichen Proteinen reguliert. Die gemeinsame Grundlage dieser
Prote infamilie stellt die Faltung des gesamten Proteins oder einer seiner
Domänen dar. Ubl5 ist ein Mit glied dieser Familie, dessen Homologe in
eukaryontischen Lebewesen stark konserviert sind. Ab gesehen von der
strukturellen Ähnlichkeit mit Ubiquitin besitzt es wenig Übereinstimmung in
der Aminosäuresequenz und wird, soweit bekannt, nicht kovalent an Zielproteine
gebunden. In dieser Arbeit wurde das homologe Protein der Bäckerhefe Hub1, auf
dessen Interaktionspartner sowohl auf genetischer als auch auf Proteinebene
untersucht. So konnten eine synthetisch letale Interak tion zwischen Hub1 und
einer P1484L-Mutation im Splicing-Faktor PRP8, sowie weitere genetische
Interaktionen nicht-essentieller Komponenten des Spliceosoms und des prä-mRNS-
Retentions systems charakterisiert werden. Sowohl die Prp8-Mutante, als auch
die Deletion von Hub1 führen zu Splicing-Defekten von Introns mit
ungewöhnlichen 5'-Spleißstellen. In Zellen ohne Hub1 wur de zusätzlich ein
Anstieg der aus dem Kern exportierten, ungespleißten prä-mRNS festgestellt.Da
bisher keine Informationen über funktionale Aminosäurereste von Hub1 bekannt
waren, wurden durch PCR-basierte Mutagenese Hub1-Mutanten generiert und deren
Funktion durch die charakterisierten genetischen Interaktionen (in vivo), als
auch durch die Bindung an Snu66 (in vi tro) überprüft. Dabei konnten Bereiche
von Hub1 festgestellt werden, bei denen Mutationen ent weder die Bindung an
Snu66 störten, aber für die Komplementation der genetischen Interaktion nicht
essentiell waren, und umgekehrt. Hub1 beeinflusst demnach die Effizienz, mit
der bestimmte Transkripte gespleißt und im Zell kern zurückgehalten werden.
Beide Mechanismen sind auf die korrekte Erkennung der 5'-Spleiß stelle
angewiesen, wodurch eine Funktion von Hub1 bei diesem Prozess vermutet werden
kann.
de
dc.description.abstract
Biochemical reactions and localization of proteins or other cellular factors
are often regulated by signaling molecules. In addition to phosphorylation,
methylation or acetylation of amino acid residues, modification of proteins
with ubiquitin or ubiquitin-like modifiers is a key process of regulation.
This protein family is characterized by a similar structural fold of either
the whole protein or one of their domains. Ubl5 is a member of this protein
family, that is highly conserved within eucaryotes. Aside from its tertiary
structure, it shares only weak similarity with ubiquitin and seems not to be
attached covalently to other proteins. The focus of this work was the S. cere
visiae homologue Hub1 and its physical and genetic interactions. The deletion
of Hub1 leads to genetic interactions with several splicing factors, including
a P1384L mutation in Prp8 and members of the U4/U6.U5 tri-snRNP and the
complexes containing Prp19 and Cef1. Moreover, the deletion of Hub1 also leads
to an increased leakage of unspliced pre-mRNA to the cytoplasm. Since there
was no information available, which amino acid residues of Hub1 were essential
for its function, a set of Hub1 mutants with substitutions of single amino
acids was generated and tested for their protein stability, their ability to
bind the only known direct interaction partner Snu66 and their function to
complement the genetic interactions. Distinct areas at the surface of Hub1
were found, that showed reduced binding of Snu66 in vitro, but kept their
function to com plement the genetic interactions, and vice versa. The
deletion of Hub1 showed a decrease in the splicing efficiency of certain
transcripts and their retention in the nucleus. Both mechanisms depend on the
correct identification of the 5'- splice site and Hub1 may have a distinct
function in this process.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
pre-mRNA retention
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Die Funktion des Ubiquitin-ähnlichen Proteins Hub1 in S. cerevisiae
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Volker Haucke
dc.contributor.furtherReferee
Dr. Shiao Li Oei
dc.date.accepted
2009-03-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000009193-7
dc.title.translated
Cellular function of the ubiquitin-like protein Hub1 in S. cerevisiae
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000009193
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005317
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open access