Immunzytochemische Untersuchungen zur Ko-Lokalisation des neuronalen Calcium- Sensor- (NCS-) Proteins VILIP-1 mit dem nikotinischen Acetylcholinrezeptor (alpha4beta2)

Abstract

Der alpha4beta2 nikotinische Acytylcholinrezeptor (nAChR) ist die im menschlichen Gehirn am Häufigsten vertretene Rezeptorisoform und vermittelt elementare physiologische, aber auch pathophysiologische Prozesse. Der Rezeptor ist ein wichtiger Modulator der Neurotransmission, indem er die Ausschüttung der Neurotransmitter Glutamat, Dopamin und GABA reguliert. Eine besondere Bedeutung hat er innerhalb der Hippokampusformation inne, wo er als Vermittler synaptischer Plastizität fungiert und im Rahmen dessen Gedächtnisbildung und Lernen moduliert. Aufgrund dieser komplexen Funktionen nimmt der alpha4beta2 nAChR auch eine zentrale Rolle in Pathophysiologien verschiedener neurologischer (Demenz vom Alzheimer-Typ, Morbus Parkinson, aut.-dom. nächtliche Frontalllappenepilepsie) und psychiatrischer (Schizophrenie, Angsterkrankungen) Erkrankungen ein. Über die lange zytoplasmatische Schleife der alpha4-Untereinheit ist der Rezeptor in der Lage, verschiedene Interaktionen einzugehen. So auch mit dem neuronalen Calcium-Sensor- (NCS-) Visinin-like Protein 1 (VILIP-1). VILIP-1 ist ein NCS- Protein, das in der Lage ist, reversibel Calcium-abhängig an subzelluläre und Zellmembranen zu binden. Es ist bekannt, dass VILIP-1 mit weiteren Rezeptoren interagiert. So beeinflusst das Protein den Clathrin-abhängigen Rezeptortransport des Transferrinrezeptors und der Guanylatzyklase B. Die Interaktion mit dem alpha4beta2 nAChR konnte bisher im Zellkulturmodell und in Oozyten nachgewiesen werden, wo VILIP-1 das Vorkommen des Rezeptors an der Zellmembran und die Sensitivität gegenüber Agonisten erhöht. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels immunfluoreszenzchemischer Untersuchungen erstmals eine Interaktion von VILIP-1 und dem alpha4beta2 nAChR in der primären hippokampalen Neuronenkultur nachgewiesen werden. Weiterführend konnte der Golgi-Apparat als Ort der Einflussnahme herausgestellt werden. Sowohl VILIP-1 als auch der Rezeptor ko-lokalisieren Calcium-abhängig am trans-Golgi Netzwerk. Es ist anzunehmen, dass dort die Translokation des Rezeptors an die Oberfläche, nach Calcium-Einstrom, initiiert wird. Als möglicher Mechanismus konnte zum Einen der Einfluss auf Recyclingprozesse Syntaxin 6 positiver Stachelsaumvesikel (Clathrin-coated vesicles) dargestellt werden. Zum Anderen scheint auch eine Beeinflussung der Exozytose, gezeigt in pharmakologischen Experimenten, stattzufinden. Eine weitere Folge der Protein- Rezeptor-Interaktion ist die Steigerung der Sensitivität und des Rezeptorvorkommens (an Membranen) des alpha4beta2 nAChR. In diesem Zusammenhang erfolgt ein vermehrtes Vorkommen hochaffiner Bindungsstellen und eine erhöhte Reizantwortstärke auf ACh-Stimulation in hippokampalen Neuronen. VILIP-1 kann über diese funktionelle Hochregulation des alpha4beta2 nAChR die nikotinerge Neurotransmission (Prozesse synaptischer Plastizität) und Interneuronaktivität modulieren. Des Weiteren kann eine Hypothese zur Rolle von VILIP-1 in der Pathophysiologie der Demenz vom Alzheimer-Typ und Schizophrenie diskutiert werden.

Alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is the most abundant nAChR subtype in the brain and crucial for various physiological and pathological processes. The receptor modulates neurotransmission by release of glutamate, dopamine and GABA. In the hippocampus the receptor regulates synaptic plasticity, an indispensable process to induce learning and memory. Due to these complex functions alpha4beta2 nAChR plays a key role in several pathological processes of neurological (Alzheimer`s and Parkinson`s disease, autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy) and psychiatric (schizophrenia, anxiety disorders) diseases. Via the long cytoplasmic loop of the alpha4-subunit the receptor interacts with a variety of proteins one of these being the neuronal calcium-sensor protein visinin-like-protein 1 (VILIP-1). It binds in a calcium dependent manner, reversibly on subcellular and surface membranes. The Interaction with the alpha4beta2 nAChR was recently shown in cell culture and in oocytes, whereVILIP-1 increased the receptor`s surface abundance and the agonist sensitivity. Besides nAChR, VILIP-1 is known to interact with several other receptors, such as transferrin receptor and guanylate cyclase B. Moreover, it influences clathrin dependent receptor trafficking. In this work we demonstrate for the first time an interaction of VILIP-1 with alpha4beta2 nAChR in a primary culture of hippocampal neurons. By use of immunohistochemical staining we located the interaction in the trans- golgi network of the golgi apparatus where VILIP-1 and the alpha4beta2 nAChR are co-localised in a calcium dependent manner. We assume that it is here where after calcium influx the translocation of the receptor to the surface is initiated. As putative mechanisms we demonstrated an influence on both, recycling processes in syntaxin 6 positive clathrin coated vesicles as well as exocytosis, which was shown by pharmacological experiments. As a consequence of the protein-receptor interaction we demonstrated a higher receptor abundance at the surface and a higher receptor sensitivity. The latter being due to an increased availability of highly affine receptor binding sites and an increased signal response upon ACh –stimulation in hippocampal neurons. Via this functional upregulation of alpha4beta2 nAChR VILIP-1 modulates the nicotinergic transmission, a process of synaptic plasticity, and the activity of interneurons. This implicates a role of VILIP-1 in the pathogenesis of Alzheimer´s disease and schizophrenia.