Pulmonale Immunstimulation mit Lipopeptid MALP-2: Einfluss auf den Verlauf der Pneumokokkenpneumonie in der Maus

Abstract

Die ambulant erworbene Pneumonie ist eine der häufigsten lebensbedrohlichen Infektionserkrankungen der heutigen Industrieländer und geht mit hoher Morbidität und Mortalität einher. S. pneumoniae ist der häufigste Erreger der AEP. Eine inadäquate Immunantwort, hervorgerufen durch akute oder chronische Primärerkrankungen, Langzeitbeatmung oder Sepsis-assoziierte Immunparalyse, erhöht das Risiko, an einer Pneumokokkenpneumonie zu erkranken. Spezifische Strategien zur Verbesserung der angeborenen Immunabwehr der Lunge fehlen jedoch weitgehend. In vivo Studien zeigten, dass die lokale Immunstimulation mit bakteriellen Bestandteilen oder spezifischen synthetischen TLR-Agonisten die pulmonale Immunabwehr verbessern und protektiv bei verschiedenen nachfolgenden Lungeninfektionen wirkt. Die pulmonale Immunstimulation vor einer Infektion stellt somit möglicherweise eine vielversprechende alternative Therapiestrategie dar. Der toll-like Rezeptor 2 (TLR-2) erkennt neben Lipoteichonsäure und Peptidoglykanen auch Lipoproteine und Lipopeptide und ist bei der Pneumokokkenpneumonie an der Induktion einer frühen Immunantwort beteiligt. Eine spezifische Stimulation des TLR-2 mit dem synthetischen MALP-2 bewirkte darüber hinaus die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen in vitro und die lokale Rekrutierung von Entzündungszellen in vivo. Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit war es, den Einfluss einer TLR-2-spezifischen lokalen Immunstimulation mit dem synthetischen Lipopeptid MALP-2 auf die pulmonale Immunantwort, die Erregerelimination und den klinischen Verlauf bei der Pneumokokkenpneumonie im etablierten Mausmodell zu untersuchen. Dabei wurde zunächst die Auswirkung von MALP-2 auf das angeborene Immunsystem der Lunge analysiert. Dazu erfolgte in vivo die intratracheale Applikation von MALP-2 und nachfolgend die Untersuchung der lokalen Zytokinfreisetzung und der Rekrutierung von Entzündungszellen in den bronchoalveolären Raum. Zusätzlich wurde die Rolle des TLR-2 anhand von Wildtyp- und TLR-2-defizienten Mäusen in vivo sowie in Zellkultur in vitro eruiert. In weiteren experimentellen Untersuchungen wurden Tiere 24 h nach intratrachealer Applikation von MALP-2 mit S. pneumoniae infiziert. Anschließend erfolgte die Analyse der lokalen Entzündungsreaktion sowie des klinischen Verlaufes bei der murinen Pneumokokkenpneumonie. Beachtung fanden hierbei insbesondere die pulmonale Zytokinproduktion und Leukozytenrekrutierung in den Atemwegen sowie die Erregerelimination und die Überlebensraten im Verlauf der Pneumokokkenpneumonie. Die lokale Applikation von MALP-2 in die Lunge bewirkte in Abhängigkeit von TLR-2 die lokale Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen sowie die Rekrutierung von Leukozyten in den bronchoalveolären Raum. MALP-2 erhöhte darüber hinaus die Genexpression des TLR-2 in der Lunge in vivo und in humanen Alveolarepithelzellen in vitro sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Die lokale Applikation von MALP-2 24 h vor der intranasalen Infektion mit S. pneumoniae verursachte eine erhöhte Freisetzung von CCL5 (RANTES) in Verbindung mit einer gesteigerten Rekrutierung von Leukozyten und einer verminderten Produktion des anti- inflammatorischen IL-10 in den bronchoalveolären Raum. Die Gesamtleukozytenzahl und das Differentialzellbild im Blut blieben jedoch unverändert. Klinisch zeigten MALP-2-vorbehandelte Tiere im Vergleich zu kontrollbehandelten infizierten Tieren höhere Überlebensraten sowie weniger Gewichtsverlust und Abfall der Körpertemperatur bei der Pneumokokkenpneumonie. MALP-2 bewirkte ferner eine Reduktion der Bakteriämie und verbesserte die Elimination von S. pneumoniae im Lungenparenchym. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die pulmonale Immunstimulation mit MALP-2 vor der Infektion mit S. pneumoniae die lokale Immunabwehr verbessert und die Überlebensrate der murinen Pneumokokkenpneumonie erhöht. Die präventive lokale Immunstimulation könnte somit für Patienten mit einem erhöhten Risiko, an einer Pneumokokkenpneumonie zu erkranken, eine vielversprechende pharmakologische Interventionsstrategie darstellen.

Community-acquired pneumonia (CAP) is a significant cause of morbidity and mortality worldwide, and Streptococcus pneumoniae is the major causative agent of.CAP. The risk of pneumococcal pneumonia may be greatly increased in specific pathologic situations with impaired pulmonary host defense including acute or chronic primary diseases, long-term ventilation or sepsis-associated immune paralysis. However, specific strategies to strengthen the pulmonary host defense are rare. Pre-activation of the pulmonary immune system with bacterial components or specific synthetic TLR-agonists has been reported to improve local host defense and increase resistance to various experimental pulmonary infections. Thus, pulmonary immune stimulation prior to infection may be a promising alternative therapeutic strategy. Toll-like receptor-2 (TLR-2) recognizes microbial components including lipoteichoic acid, peptidoglycan as well as lipoproteins and lipopeptides. TLR-2 contributes to the induction of early immune responses in pneumococcal pneumonia. Further, TLR-2 specific stimulation with MALP-2 induced the release of proinflammatory cytokines in vivo and recruited leukocytes to the local site of stimulation in vivo. In the current study, the effect of local TLR-2 mediated immune stimulation with MALP-2 on the pulmonary host defense, the bacterial clearance and the course of pneumococcal pneumonia was investigated in a murine model of pneumococcal pneumonia. Mice were treated with intratracheal injections of MALP-2 and the pulmonary innate immune response was analysed including inflammatory cytokine release and leukocyte recruitment into the bronchoalveolar space. In addition, the role of TLR-2 was investigated in vivo using wildtype and TLR-2-deficient mice, as well as in vitro, human alveolare epithelial cells. Furthermore, mice were infected with S. pneumoniae 24 h after intratracheal MALP-2 application. The pulmonary immune response and the course of murine pneumococcal pneumonia after MALP-2 pretreatment were examined with respect to pulmonary cytokine production, leukocyte immigration, bacterial clearance and survival rates. In the presence of TLR-2, intratracheal MALP-2 application evoked inflammatory cytokine and chemokine release, resulting in leukocyte immigration into the bronchoalveolar space. MALP-2 increased TLR-2 expression levels at both mRNA and protein level in murine lungs in vivo and in human alveolar epithelial cells in vitro. Pulmonary pretreatment with MALP-2 24 h before intranasal pneumococcal infection resulted in increased levels of CCL5 (RANTES) associated with augmented leukocyte recruitment, and decreased levels of anti-inflammatory IL-10 in the bronchoalveolar lavage fluid. Blood leukocyte numbers and populations remained unchanged. Importantly, MALP-2-pretreated as compared to untreated mice showed increased survival, decreased loss of body weight as well as reduced hypothermia in pneumococcal pneumonia. MALP-2 also reduced bacteremia and improved pneumococcal clearance in lung parenchyma. In conclusion, pulmonary immunostimulation with MALP-2 before infection with S. pneumoniae improved local host defense and increased survival in murine pneumococcal pneumonia. Thus, preventive pulmonary immunostimulation may provide a promising pharmacological strategy for high-risk patients to improve pneumococcal pneumonia outcome.