cGMP signalling via CNP-NPR2-cGKI, and its role in axonal branching during embryonic development

Abstract

Axon guidance to its targets is accomplished not only via navigation of the primary growth cone but also by initiation and elaboration of branches. Axonal branching enables innervation of multiple targets by the same neuron, leading to the formation of a complex neural network. Whereas guidance of a growth cone is a quite well studied phenomenon, axonal branching is less understood. In this work I studied branching of DRG axons, which display two modes of branching – bifurcation and interstitial branching. Based on results of previous works, suggesting that cGKI is required for sensory axon bifurcation, I analysed cGKI knock-out mice using DiI tracing to confirm initial observations. cGKI is a part of cGMP signalling, therefore, I analysed mice mutant for other components of cGMP signalling pathway, namely Npr2 and CNP, by DiI labelling. The results of this analysis demonstrated that CNP, Npr2 and cGKI act in a cGMP signalling cascade, which is crucial for sensory axon bifurcation. Sensory axons in all mice mutant for CNP-Npr2-cGKI signalling do not bifurcate at the dorsal root entry zone, instead they turne either to rostral or caudal direction. Interestingly, interstitial branching of sensory axons is not impaired by deficient cGMP signalling. I analysed branching of pyramidal neuron dendrites in cortex and hippocampus as well as central projection of trigeminal sensory axon in order to determine, whether bifurcations observed there are regulated by cGMP signalling. The results demonstrated that bifurcation of central projection of trigeminal sensory axon is indeed regulated by cGMP signalling. In the cGKI knock-out mouse trigeminal sensory axons do not bifurcate upon reaching the brainstem but turn to join either the ascending or descending tract. Further, I searched for downstream target(s) of cGKI that would play a role in sensory axon bifurcation. First of all, I analysed known/putative targets of cGKI. VASP was already shown to be phosphorylated by cGKI in DRG. I could demonstrate that Mena and GSK3- are also phosphorylated in DRG upon stimulation of cGKI. Analysis of Mena/VASP double knock-out mouse as well as analysis of GSK3- double knock-in mouse using DiI tracing demonstrated, that sensory axon bifurcation is not impaired, suggesting that VASP, Mena and GSK3- are not crucial for sensory axon bifurcation. Search for new phosphorylation targets of cGKI using the antibody recognizing a motif, preferably phosphorylated by cGK - RRXpS/pT - resulted in detection of several proteins phosphorylated, and, interestingly, one protein dephosphorylated upon stimulation of cGKI. This work elucitated CNP-Npr2-cGKI signalling which is crucial for sensory axon bifurcation. It remains unclear, whether a single phosphorylation target of cGKI, which alone would induce bifurcation, exists, or it is rather a network of multiple cGKI targets, which can be unfolded only by knock-out of multiple components of such network.

Die Führung der Axonen zu ihren Zielen wird nicht nur über die Navigation des primären Wachstumskegels sondern auch durch die Initiation und Weiterentwicklung von Verzweigungen vollbracht. Die axonale Verzweigung ermöglicht innervation von vielfachen Zielen durch dasselbe Neuron, zur Bildung eines komplizierten Nervennetzes führend. Wohingegen die Leitung eines Wachstumskegels ist ein ganz gut studiertes Phänomen, axonale Verzweigung ist weniger verstanden. In dieser Arbeit studierte ich die Verzweigung von Spinalganglienaxonen, welche zwei Weisen der Verzweigung – die Vergabelung und die interstitielle Verzweigung zeigen. Beruhend auf Ergebnisse von vorherigen Arbeiten vorschlagend, dass cGKI für die axonale Vergabelung erforderlich ist, analysierte ich cGKI Knock-out-Mäuse, mittels DiI Färbung, um anfängliche Beobachtungen zu bestätigen. cGKI ist ein Teil der cGMP-Signalkaskade deshalb, ich analysierte Maus-Mutanten für andere Bestandteile von cGMP Signalpfad, nämlich Npr2 und CNP mittels DiI Färbungn. Die Ergebnisse dieser Analyse demonstrierten, dass CNP, Npr2 und cGKI sind Komponenten von cGMP Kaskade, die für die axonale Verzweigung entscheidend ist. Sensorische Axonen im Maus- Mutanten für die CNP-Npr2-cGKI-Signalkaskade vergabeln sich an der Dorsalwurzelzugangzone nicht, stattdessen drehen sie sich entweder zur rostralen oder caudalen Richtung. Interessanterweise, wird die interstitielle Verzweigung von sensorischen Axonen durch die abwesende cGMP-Signalkaskade nicht verschlechtert. Ich analysierte die Verzweigung von Dendriten der pyramidalen Neuronen- im Kortex und Hippocampus sowie zentrale Projektionen von trigeminalen sensorischen Axonen, um zu bestimmen, ob Vergabelungen beobachtet dort durch die cGMP-Nachrichtenübermittlung geregelt werden. Die Ergebnisse demonstrierten, dass die Vergabelung der zentralen Projektion vom trigeminalen sensorischen Axon tatsächlich durch die cGMP-Signalkaskade geregelt wird. In der cGKI Knock-Out-Maus trigeminale sensorische Axone vergabeln sich auf das Erreichen vom Stammhirn nicht, aber drehen sich, um sich entweder dem steigenden oder der hinuntersteigenden Axonentrakt anzuschließen. Weiter suchte ich nach Substraten von cGKI, die eine Rolle in der Vergabelung von Axonen spielen würde. Zuallererst analysierte ich bekannte/vermeintliche Substraten von cGKI. Wie man bereits zeigte, wird VASP phosphoryliert durch cGKI in Spinalganglien. Ich konnte demonstrieren, dass Mena und GSK3- auch phosphoryliert in Spinalganglien auf die Anregung von cGKI werden. Die Analyse von der Mena/VASP doppelt Knock-out-Maus sowie Analyse von der GSK3- doppelt Knock-in-Maus mittels DiI Färbung zeigte, dass die Vergabelung der Axonen nicht verschlechtert wird, vorschlagend, dass VASP, Mena und GSK3- für die Vergabelung der Axonen nicht entscheidend sind. In der Suche nach neuen Phosphorylierung Substraten von cGKI wurde der Antikörper, der ein Motiv, vorzugsweise phosphorylated durch cGK - RRXpS/pT anerkennt, verwendet. Das führte zur Entdeckung von mehreren Proteinen, die phosphoryliert, und, interessanterweise, ein Protein, das dephosphoryliert auf die Anregung von cGKI wurde, hinaus. Diese Arbeit erläuterte CNP-Npr2-cGKI Signalkaskade, die für die Vergabelung der Axonen entscheidend ist. Es bleibt unklar, ob ein einzelnes Phosphorylation-Substrat von cGKI, das allein die Vergabelung veranlassen würde, besteht, oder das eher ein Netz von vielfachen cGKI-Substraten existiert, der nur durch das knock-out von vielfachen Komponenten solchen Netzes entfaltet werden kann.