Development of a tool to probe the biomechanical properties of the endothelial surface layer

Abstract

Introduction: We have recently found in isolated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) that turbulent (atheroprone) vascular shear stress (VSS) down regulates endothelial connexin 40 and up regulates C6- and V1-type transient receptor potential (TRP) channels. However the mechanism for these atheroprone changes is poorly understood. We have shown that atheroprone VSS profile down regulates the synthesis of a major component of the endothelial surface layer (ESL), hyaluronan (HA). These findings together with the extensive amount of publications showing the importance of ESL in endothelial VSS sensation led us to speculate, that HA might be part of an atheroprone circulus vitiosus: in the absence of atheroprotective VSS, HA expression decreases. This leads to decrease of vascular VSS sensitivity followed by further reduction of HA expression. Thus we aimed at developing a tool to probe the properties and thickness of the surface layer of cultured HUVECs to allow investigation the role of HA for VSS related alterations of the ESL. Methods: A defocus imaging based single particle tracking application was developed. It allows tracking the 3D position of fluorescent nanobeads with a precision beyond the diffraction resolution limit. Local viscosity can be assessed by quantifying the nanobeads’ Brownian motion. Results and conclusion: For a vertical range of 4.5 µm, the validity of vertical single particle tracking was 16 nm, with a precision of about 5 nm. In the horizontal plane precision was 5 nm. In first experiments with HUVEC we could show an increase of local viscosity in a region close to the cell surface with a thickness of about 1000 nm which may correspond to the ESL. Thus, the established approach has the potential to study biophysical properties of the ESL, including thickness and viscosity. This should allow to investigate the alteration of ESL beside different pathological conditions.

Einführung: In vorhergehenden Untersuchungen konnten wir zeigen, dass in isolierten Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen (HUVEC) durch pulsatile Wandschubspannung bei unidirektionaler laminarer Strömung („atheroprotective flow profile“) die Expression von Konnexin40 und HAS2 induziert wird. Dagegen wird die Expression von TNFα sowie C6- und V1-Transient Rezeptor Potential (TRP) Ionkanälen bei relativ niedriger, oszillierender Wandschubspannung (atherogenes Strömungsprofil) induziert. Wir konnten auch zeigen, dass durch ein atherogenes Strömungsprofil die Synthese der wichtigsten Komponente der endothelialen Oberflächenschicht (ESL), der Hyaluronsäure (HA) unterdrückt wird. In Verbindung mit der umfangreichen Literatur über die Bedeutung des ESL für die Schubspannungsempfindlichkeit von Endothelzellen führen diese Ergebnisse zu der Vermutung, dass die ESL eine zentrale Rolle in einem proatherogenen circulus vitiosus spielen könnte: durch atherogene Strömungsbedingungen wird die HA-Synthese reduziert, dies führt zur Reduktion der ESL Dicke und der Schubspannungs-Empfindlichkeit des Endothels und damit zur weiterer Unterdrückung der Hyaluronsäureexpression. Um diese Hypothese testen zu können und die Rolle von Hyaluronsäure und Schubspannung für Veränderungen der ESL zu überprüfen, wurde eine Methode zur direkte Messung der Eigenschaften und Dicke der ESL von primären kultivierten Endothelzelle entwickelt. Methoden: Die Dicke der ESL beträgt ca. 0.5-1 µm und erfordert damit Messverfahren unterhalb der Auflösungsgrenze des Lichtmikrokops. Dies wurde durch Bestimmung des Durchmessers von Beugungsringen fluoreszierender Nanopartikel außerhalb der Fokusebene erreicht. Zur off-line Auswertung entsprechender mikroskopischer Aufnahmen erfolgte mit einem eigenen Programm zum automatisierten Einzelpartikel-Tracking. Neben der Bestimmung der Position des jeweiliges Partikels in den drei Raumachsen war so zugleich die Messung der Viskosität des umgebenden Mediums möglich. Ergebnisse und Zusammenfassung: Über einen vertikalen Bereich von 4,5 µm betrug die Validität für die Lokalisation einzelner Nanopartikel in der Senkrechten 16 nm bei einer Präzision von etwa 5 nm in der Vertikalen und 5 nm in der Horizontalen. In ersten Experimenten mit HUVECs, konnten wir einen Anstieg der Viskosität in Bereichen nahe der Zelloberfläche mit einer Schichtdicke von etwa 1000nm zeigen. Dieser Bereich könnte der endothelialen Oberflächenschicht entsprechen. Somit hat das entwickelte Verfahren das Potential, die biophysikalischen Eigenschaften der ESL, besonders Viskosität und Dicke, zu untersuchen. Damit können die wandschubspannungs-bedingten frühen Effekte der endothelialen Dysfunktion, insbesondere die Bedeutung der ESL und der Hyaluronsäure, weiter untersucht werden.