Rolling Circle Amplification auf Biochips

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war es, Ansätze für Nachweissysteme von Biomolekülen zu entwickeln, die auf dem Prinzip der Rolling Circle Amplification beruhen. Dafür wurde zunächst ein Protokoll zur enzymatischen Synthese des Ausgangsmaterials der RCA, eines zirkulären Oligonukleotids, erstellt und optimiert. Mit dem zirkulären Oligonukleotid wurde ein RCA-Protokoll in Lösung entwickelt. Der Nachweis der Produkte der RCA erfolgte direkt über den Einbau von markierten Nukleotiden und indirekt durch die Hybridisierung von markierten Sonden an das Rolling Circle Product (RCP) und wurde mittels Dot Blots analysiert. Das erfolgreich etablierte RCAProtokoll wurde auf magnetische Beads und auf Microarrays übertragen. In diesem miniaturisierten Format war es möglich, das RCP direkt und indirekt nachzuweisen. Die Untersuchung verschiedener Linkerlängen der Primer und des Biotin-dUTPs zeigte, dass bei Verwendung eines immobilisierten Primers mit einer Linkerlänge von 17 Nukleotiden und dem Biotin-dUTP ohne Linker auf dem Microarray die höchsten Fluoreszenzintensität der RCA erzielt wurden. Alternativ zu diesen herkömmlichen Nachweissystemen wurde ein Ansatz entwickelt, der die RCA mit katalytisch aktiven Nukleinsäuresequenzen, den DNAzymen kombiniert. Für diesen Ansatz wurden DNAzyme mit einer Peroxidase- Aktivität verwendet. Zunächst wurden die DNAzyme der ersten und der zweiten Generation charakterisiert. Über die RCP-Synthese war es möglich, gekoppelte DNAzyme herzustellen und deren katalytische Aktivität durch den Umsatz des Eduktes zu einem Fluoreszenzfarbstoff zu messen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein neuer Ansatz, der Hotpot-Assay, entwickelt. In dem Hotpot-Ansatz laufen alle Reaktionen der RCA und der DNAzyme kombiniert in einer homogenen Lösung ab. Der Hotpot-Assay wurde von einem 70 μl Ansatz im 96er Mikrotiterplatten-Format erfolgreich auf 50 nl miniaturisiert in Nano-Well- Chips durchgeführt. Durch die Kombination von RCA und einem DNAzym der ersten Generation in einem Volumen von 50 nl konnten 4.600 Moleküle nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten direkten, indirekten und alternativen Nachweissysteme können als Sensoren dienen und können mit analytspezifischen Bindungspartnern wie Nukleinsäuresonden, Antikörpern oder Aptameren kombiniert werden. Mit dem Hotpot-Assay wurde ein sehr sensitiver Ansatz erarbeitet, der für den Nachweis von Biomolekülen, die in geringen Stoffmengen vorliegen, weiter entwickelt werden kann und damit für die klinische Diagnostik, die Lebensmittelindustrie, die Forschung und im speziellen für Lab-on-a-Chip-Modelle von großer Bedeutung ist.

The aim of this work was the development of alternative detection assays based on the Rolling Circle Amplification (RCA). Therefore the protocol for the enzymatic synthesis of the starting material for the RCA a circular oligonucleotide was optimised. With this circular oligonucleotide a protocol for the RCA in solution was developed. The detection of the Rolling Circle Product (RCP) was carried out directly by incorporation of labelled nucleotides and indirectly by labelled probes and was analysed via dot blots. The successfully established protocol for the RCA in solution was transferred to an approach using magnetic beads and miniaturised to microarrays. The direct and indirect detection of the RCP was also possible for this miniaturised format. Analysis of the spacer lengths of the immobilised primer and the biotin-dUTP revealed that a 17 nucleotide long spacer and biotin-dUTP without a spacer showed the highest fluorescence signals after RCA on microarrays. As an alternative to the common detection approaches an assay was developed which combined the RCA with catalytic nucleic acid sequences, so- called DNAzymes. For this approach a DNAzyme with a peroxidase activity was used. First the catalytic activity of first and second generation DNAzymes was characterised. Through the RCP synthesis it was possible to produce linked DNAzymes and to measure their catalytic activity by the turnover of an educt to a fluorescent dye. Based on these results a new assay, the hotpot assay was developed. The hotpot assay works by adding all required components in one step to the wells. It combines all reactions in a homogeneous mix. This assay was subsequently miniaturised from 70 μl in 96 well plates to 50 nl in nano- well chips. With this alternative assay 4,600 molecules could be detected in a 50 nl per cavity using the combination of RCA and first generation DNAzymes. The presented direct, indirect and alternative detection systems can serve as sensor and can be combined with analyte specific detection molecules like antibodies, aptamers or nucleic acid probes. With the hotpot assay a very sensitive approach was developed, which can be further improved for the detection of biomolecules in low amounts. Therefore it has a great potential for clinical diagnostic, food industry, research and lab-on-a-chip systems.