Role of the herpesvirus telomeric repeats and the protein U94 in human herpesvirus 6 integration

Abstract

Human herpesvirus 6 (HHV-6) is a betaherpesvirus related to the human cytomegalovirus. It is the causative agent of roseola infantum, a febrile illness in infants, and has a seroprevalence of over 90 % worldwide. Upon primary infection, HHV-6 establishes a persistent infection in the host for life termed latency, mostly in bone marrow progenitor cells, monocytes and macrophages. Reactivation from latency preferentially occurs in immunocompromised individuals and is associated with several diseases including encephalitis, multiple sclerosis, graft rejection as well as a more rapid AIDS progression. HHV-6 has previously been shown to integrate its genetic material into telomeres of human chromosomes, a mechanism that allows vertical transmission of the virus via the germline, resulting in individuals that harbor the integrated virus in every single cell of their body. This condition is termed ciHHV-6 (chromosomally integrated HHV-6) and is present in roughly 1 % of the human population. The molecular mechanism and the factors involved in HHV-6 integration remain completely unknown. Intriguingly, HHV-6 and several other herpesviruses harbor arrays of telomeric repeats (TMRs) at their genome termini that are identical to human telomere sequences. The TMRs in HHV-6 have been termed perfect TMRs (pTMRs) and imperfect TMRs (impTMRs), and have been proposed to facilitate homologous recombination (HR). Furthermore, HHV-6 encodes the U94 gene that contains all conserved domains of the Rep recombinase of Adeno-associated virus 2 (AAV-2). Expression of U94 restores replication of a Rep-deficient AAV-2, suggesting that both proteins have similar functions. Indeed, recently it was confirmed that a purified MBP-U94 fusion protein has DNA-binding, ATPase, helicase and exonuclease activities as described for Rep. However, the actual role of U94 and the TMRs in HHV-6 replication and integration remains elusive. To determine whether the TMRs are involved in HHV-6 integration, I deleted the two distinct sets of TMRs, individually or simultaneously, in a bacterial artificial chromosome (BAC) of HHV-6A by en passant mutagenesis. Upon reconstitution, the TMR mutant viruses replicated comparable to wild type (wt) and revertant viruses, indicating that the TMRs are not essential for HHV-6A replication. To assess the integration properties of the recombinant viruses, I established an in vitro latency system that allows assessment of integration efficiency and genome maintenance in latently infected U2OS cells. Fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses revealed that integration is severely impaired in the absence of the TMRs. The genome of the TMR mutants was poorly maintained in latently infected cells, suggesting that integration is crucial for the maintenance of the virus genome. To investigate the role of the putative HHV-6 recombinase, the ORF U94 was either deleted entirely from the HHV-6A BAC or its expression was abrogated by introducing a premature stop codon. Integration efficiencies of the U94 mutants were not altered compared to wt and revertant viruses in the U2OS integration assay, suggesting that U94 is not essential for HHV-6A integration. In addition, inhibiting the cellular recombinase Rad51, using a specific inhibitor, also did not significantly change the integration frequencies of the viruses, indicating that other viral or cellular recombinases can complement the function of U94 and Rad51 in HHV- 6A integration.

Das Humane Herpesvirus 6 (HHV-6) gehört zu den Betaherpesviren und ist eng verwandt mit dem humanen Cytomegalievirus. HHV-6 verursacht die Kinderkrankheit Roseola Infantum und hat eine weltweite Seroprävalenz von über 90 %. Nach überstandener Primärinfektion kann HHV-6 im Wirt eine persistierende Infektion ausbilden, die sich durch lebenslange Latenz des Virus in Knochenmark-Vorläuferzellen, Monozyten und Makrophagen auszeichnet. Eine Reaktivierung des Virus tritt häufig bei immunsupprimierten Patienten auf und wird in diesen Fällen mit Krankheitsbildern wie Enzephalitis, Multipler Sklerose, Transplantatabstoßung und einem schnelleren Vorschreiten von HIV zu AIDS in Verbindung gebracht. Es wurde gezeigt, dass HHV-6 sein genetisches Material in die Telomere von humanen Chromosomen einbauen kann. Dieser Mechanismus erlaubt die vertikale Übertragung des Virus durch die Keimbahn, was dazu führt, dass in betroffenen Individuen das integrierte Virus in jeder Körperzelle vorzufinden ist. Dieser Zustand wird als chromosomal integriertes HHV-6 (ciHHV-6) bezeichnet und kann in circa 1 % der Weltbevölkerung nachgewiesen werden. Bis heute sind der Integrationsmechanismus, sowie die benötigten Faktoren gänzlich unbekannt. Interessanterweise besitzen HHV-6 und einige andere Herpesviren Telomersequenzen (TMRs) an ihren Genomenden, die identisch mit den Sequenzen humaner Telomere sind. In HHV-6 werden diese als perfekte TMRs (pTMRs) und nicht-perfekte TMRs (impTMRs) bezeichnet und es wird angenommen, dass sie homologe Rekombination zwischen Virus und Wirt ermöglichen. Des Weiteren kodiert HHV-6 für das Gen U94, das alle konservierten Domänen der Rekombinase Rep des Adeno-assoziierten Virus 2 (AAV-2) aufweist. Die Expression von U94 konnte nachweislich die Replikation eines Rep-defizienten AAV-2 wiederherstellen, was darauf hindeutet, dass beide Proteine vergleichbare Funktionen ausüben. In der Tat wurde vor kurzem gezeigt, dass U94 in vitro DNA-bindungs-, ATPase-, Helikase- und Exonuklease- Aktivitäten besitzt, wie sie auch für Rep beschrieben ist. Die tatsächliche Rolle dieser beiden viralen Faktoren im Verlauf der Integration von HHV-6 ist aber immer noch ungeklärt. Um die Funktion der TMRs während der HHV-6 Integration aufzuschlüsseln, wurden beide TMR Sequenzen, entweder einzeln oder gleichzeitig, in einem bakteriellen artifiziellen Chromosom (BAC) des HHV-6A mit Hilfe der en passant Mutagenese Methode beseitigt. Nach erfolgreicher Rekonstitution, replizierten die TMR Mutanten vergleichbar mit dem Ursprungsvirus (wt), was dafür spricht, dass die TMR Sequenzen nicht zwingend notwendig für die Replikation von HHV-6A sind. Um die Integrationseigenschaften der rekombinanten Viren zu untersuchen, habe ich ein in vitro Latenzsystem entwickelt, dass es mir ermöglicht die Integrationseffizienz, sowie den Erhalt des viralen Genoms in latent infizierten U2OS Zellen zu analysieren. Fluoreszenz in situ Hybridisierungs- Analysen (FISH) zeigten, dass die Integration der TMR Mutanten stark beeinträchtigt war im Vergleich zum Wildtyp Virus. Das Genom der TMR Mutanten wurde in den latent infizierten Zellen nur unzureichend erhalten, was dafür spricht, dass Integration essenziell für den Erhalt des Virusgenoms ist. Um Aufschluss über die Rolle der vermeintlichen Rekombinase zu erhalten, wurde zudem der offene Leserahmen von U94 gänzlich aus dem HHV-6A BAC beseitigt oder die Proteinexpression durch das Einfügen eines verfrühten Stopkodons außer Kraft gesetzt. Die resultierenden U94 Mutanten zeigten in meinen Integrationsanalysen einen vergleichbaren Phänotyp wie das Wildtyp Virus. Dies deutet darauf hin, dass U94 nicht essentiell für die Integration von HHV-6A ist. Zusätzlich zeigte auch eine Inhibierung der zellulären Rekombinase Rad51, mit Hilfe eines spezifischen Hemmstoffes, keine signifikanten Unterschiede im Bezug auf die Integrationsfrequenzen meiner Viren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es weitere zelluläre oder virale Rekombinasen gibt, die an der Integration von HHV-6A beteiligt sind.