Expressionsanalyse und funktionelle Charakterisierung von zwei neuen Tumorsuppressorgen-Kandidaten des Mammakarzinoms

Abstract

600 Kandidatengene, die möglicherweise an der Entwicklung von gynäkologischen Tumoren beteiligt sind, wurden mit Hilfe eines in silico Ansatzes (eNorthern) identifiziert. Ausgehend von diesen Kandidatengenen wurden 40 Kandidaten für die weitere Validierung ausgewählt und im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden zwei dieser 40 Kandidatengene, Tensin und SFRP1, untersucht. Für beide Kandidatengene konnten die in silico Daten auf RNA-Ebene mit mehreren unabhängigen Methoden (Northern Blot, quantitative PCR, RNA in situ Hybridisierung) bestätigt werden. Beide Gene zeigen in den Tumorzellen von gynäkologischen Karzinomen eine starke Expressionsreduktion im Vergleich zum entsprechenden Normalepithel. Da mit Mutationsanalysen keine Veränderungen der kodierenden Gensequenz nachgewiesen werden konnten, wird postuliert, dass beide Kandidatengene zur Tumorsuppressorgen Klasse II zählen. Als Komponente der Fokalkontakte ist Tensin sowohl an der Zell-Matrix-Adhäsion, als auch an der Signaltransduktion beteiligt. Die Analyse des Tensin-Expressionsmusters in Brustgewebe mit Hilfe der RNA in situ Hybridisierung zeigte eine starke Expression vor allem in Epithelzellen des normalen Brustgewebes. In Brusttumorzellen war die Tensin-Expression hingegen in ca. 50% der untersuchten Fälle reduziert oder vollständig verloren. Diese RNA-Daten stützen die auf den Daten des eNortherns basierende Hypothese, dass Tensin möglicherweise Tumorsuppressorfunktion besitzt. Es konnten keine Sequenzveränderungen in der kodierenden Sequenz des Tensin-Gens in genomischer DNA aus Brusttumorgewebe nachgewiesen werden. Das Tensin-Gen könnte während der Tumorentstehung stattdessen durch epigenetische Mechanismen wie Promotor- Hypermethylierung inaktiviert werden. Ob der Verlust der Tensin-Expression direkte Relevanz für die Tumorentstehung hat oder ob das Kandidatengen in der Tumordiagnostik als Marker verwendet werden kann, muss durch weitere Untersuchungen in Zellkultur-Modellen und auf Proteinebene, z.B. an �Tissue Microarrays�, analysiert werden. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Gen, SFRP1, ist ein negativer Regulator des Wnt-Signaltransduktionsweges, der in der Entstehung von soliden Tumoren, z.B. Brust- und Kolontumoren eine wichtige Rolle spielt. Ein selbst-generierter, polyklonaler SFRP1-Antikörper wurde charakterisiert, um die SFRP1 Expression auf Proteinebene zu analysieren und die Assoziation mit klinischen Parametern und tumorspezifischem Überleben zu untersuchen. Die Analyse von 56 in situ Karzinomen und mehr als 2000 invasiven Karzinomen ergab, dass SFRP1 in diesen Karzinomen im gleichen Maß (43% bzw. 46%) vollständig verloren ist. Das deutet darauf hin, dass der Verlust von SFRP1 ein frühes Ereignis in der Tumorentstehung darstellt. Die SFRP1 Expression ist revers mit der Tumorgröße (pT) korreliert (p < 0,001), aber es wurde keine Korrelation mit anderen klinischen Parametern wie Tumorgrad oder Lymphknotenstatus beobachtet. Dies konnte in einer multivariaten Analyse bezüglich der Assoziation von SFRP1 Expression und Tumorgröße bestätigt werden (p = 0,029). Bei der Korrelation der Überlebensdaten mit der SFRP1 Expression konnte eine schlechtere Prognose für Patientinnen mit SFRP1-negativen kleinen Tumoren (pT1) beobachtet werden (p = 0,04). Die funktionellen Analysen in Brusttumor-Zelllinien ergaben eine mögliche Funktion von SFRP1 in der Regulation der Zelladhäsion. In den hier verwendeten Modellen konnte keine Bedeutung von SFRP1 für die Kontrolle der Invasivität von Tumorzellen beobachtet werden. Ein Einfluss auf die Proliferation von Tumorzelllinien war zu bestimmten Zeitpunkten (24h und 48h) nachweisbar. Folglich ist der Verlust von SFRP1 wahrscheinlich nicht als initialer Faktor für die Tumorentstehung relevant, sondern in Verbindung mit anderen genetischen Veränderungen. SFRP1 könnte aber ein neuer prognostischer Marker in der Brustkrebs- Diagnostik/-Therapie bei frühen Tumoren sein.

600 candidate genes which are possibly involved in the development of gynecological tumors were identified using an in silico approach (eNorthern). Fourty of these candidate genes were selected for further validation within a German research consortium. This dissertation project deals with the validation of two candidate genes, Tensin and SFRP1. The in silico data for Tensin and SFRP1 were confirmed on the RNA level by three independent methods (Northern Blot, quantitative PCR and RNA in situ hybridization). Both genes show strongly reduced expression in gynecological tumors compared to normal tissue. Since no aberrations were detected in the coding sequence of both genes, I postulate that the two candidate genes belong to the group of class II tumor suppressor genes. Tensin is part of focal adhesion complexes, thus playing a role in cell-matrix adhesion as well as in signal transduction processes. The analysis of the Tensin expression pattern in mammary gland tissue using RNA in situ hybridization revealed an abundant expression in normal breast epithelial cells. Breast tumor cells exhibited a reduced expression or complete loss of Tensin in ~50% of all cases investigated in this study. The RNA expression data support the possible involvement of Tensin as a tumor suppressor gene in breast cancer development. No mutations were identified in the coding sequence of Tensin in genomic DNA isolated from breast tumor tissues. It is conceivable that the Tensin inactivation during tumor development is due to epigenetic mechanisms, i.e. promoter hypermethylation. If the loss of Tensin expression is relevant for tumorigenesis or if Tensin can be used as a novel marker in cancer diagnostics, has to be shown by further studies on protein level as well as in cell culture experiments. The second gene investigated in this thesis, secreted Frizzled-related protein 1 (SFRP1), is a negative regulator of the Wnt pathway. An SFRP1 specific antibody was generated and characterized to analyze SFRP1 expression on protein level and to investigate the association of SFRP1 expression with clinicopathological parameters and patient survival. The analysis of >2000 invasive breast tumors and 56 carcinoma in situ revealed similar frequencies of SFRP1 loss in these tumors (46% and 43% respectively). Therefore, I propose that loss of SFRP1 expression is an early event in breast tumorigenesis. SFRP1 expression was inversely correlated with tumor stage (p<0.001) but not with other prognostic parameters like tumor grade or lymph node status. Performing a multivariate analysis we could confirm the association between tumor stage and SFRP1 expression (p=0.029). In particular, loss of SFRP1 expression in early stage breast tumors (pT1) was associated with poor prognosis (p=0.04). Functional analyses revealed a possible influence of SFRP1 on the regulation of cell adhesion to the ECM whereas no effect on invasiveness of tumor cell lines was observed in the cell culture model. A possible involvement in proliferation of tumor cell was detectable at certain time points (24h and 48h). In conclusion, loss of SFRP1 is most likely not the initial event directly leading to breast tumorigenesis but facilitating breast cancer development if other genetic changes occur in the cell. Still, SFRP1 expression might be useful as a novel prognostic marker in early stage breast cancer.