RNA-Interferenz-vermittelte Gentherapie bei Herzinsuffizienz mittels Phospholamban-shRNA exprimierender adenoviraler und AAV–Vektoren

Abstract

Die Herzinsuffizienz ist eine schwere Herzerkrankung, bei der eine Störung der intramyokardialen Ca2+ - Homöostase vorliegt. Eine zentrale Rolle bei der Regulation des intrazellulären Ca2+ spielen dabei zwei Regulatorproteine, die Sarkoplasmatische Retikulum Ca-ATPase (SERCA2a) und ihr Antagonist Phospholamban (PLN). Bei Herzinsuffizienz weist die SERCA2a eine verringerte Aktivität auf, weshalb therapeutische Ansätze darauf zielen, diese wieder zu erhöhen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene adenovirale und adeno- assoziierte-Virus-(AAV) Vektoren zur Expression einer shRNA gegen PLN konstruiert, mit dem Ziel, PLN spezifisch mittels RNA - Interferenztechnologie herunterzuregulieren, damit die Aktivität der SERCA2a zu erhöhen, um schließlich einen therapeutischen Effekt bei Herzinsuffizienz in vivo zu erzielen. Zunächst konnte in primären neonatalen Rattenkardiomyozyten (PNRK) mit Hilfe des adenoviralen Vektors AdshPLNr ein fast vollständiges Gensilencing sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene erreicht werden ohne die Expression von ebenfalls an der Ca2+ - Homöostase beteiligten Proteine zu beeinflussen. Dabei führte das PLN - Silencing zu einem deutlichen Anstieg der Ca2+ - Affinität der SERCA2a. Mit Hinblick auf den Einsatz der PLN-shRNA in vivo am Zielorgan und einer langfristigen therapeutischen Nutzung wurden verschiedene mit einem self complementary (sc) Vektorgenom versehene AAV6 – Vektorkonstrukte entwickelt, die einen ausgeprägten Herzzelltropismus zeigten. Die sich anschließende systematische Charakterisierung in vitro ergab deutliche Unterschiede in ihrer Silencingeffektivität. Außerdem konnte bei diesen Untersuchungen festgestellt werden, dass zusätzliche Polymerase II - Promotor abhängige GFP - Expressionskassetten im viralen Vektorgenom einen negativen Einfluss auf die shPLNr - Expression und der Silencing - Effizienz haben. Von den hier drei näher untersuchten scAAV-shPLNr - Vektoren, erwies sich der „kleinste“ mit einer Genomlänge von ca. 1 kb ohne weitere Expressionskassetten am effektivsten. Daraufhin wurde dieses Vektorkonstrukt in einem herzinsuffizienten Rattenmodell in vivo eingesetzt, wobei allerdings das PLN-shRNA exprimierende Vektorgenom in ein AAV9 Kapsid verpackt wurde, da AAV9-Vektoren im murinen System eine nahezu 100 % Transduktionsrate kardialer Zellen nach systemischer Applikation in vivo ermöglichen. Die Auswertung der hämodynamischen, echokardiografischen als auch der morphologischen Daten konnten erstmals den erfolgreichen Einsatz einer spezifischen shRNA in einem scAAV-Vektorkonstrukt an einem Ratten - Herzinsuffizienzmodell demonstrieren. Das Gensilencing von PLN im kardialen Phänotyp führte sowohl bei AdshPLNr behandelten Tieren als auch mit scAAV-shPLNr zu einer signifikanten Verbesserung aller kardialen Funktionen sowie zu einer Verlängerung der Überlebenszeit. Darüber hinaus zeigten diese Vektoren eine regulierende Wirkung auf im Rahmen der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie bedeutsamen microRNAs. So bewirkten die shPLN - Vektoren eine Normalisierung der microRNA Expressionslevel im Vergleich zu hypertrophierten PNRK - Kontrollen. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit dieser Arbeit sehr deutlich gezeigt werden konnte, dass die neueste Generation von scAAV - Vektoren in Kombination mit RNA - Interferenz das Potential hat, gentherapeutisch bei Herzinsuffizienz zum Einsatz zu kommen.

Heart failure is characterized by deficiencies in Ca2+ regulation linked to contraction/relaxation of the affected ventricles and the single cardiac myocytes. Central players of cardiomyocytes Ca2+ regulation are the Ca-ATPase (SERCA2a) of the sarcoplasmic reticulum (SR) and its negative modulator protein Phospholamban (PLN). The function of the latter two SR proteins has been found to be critically dysregulated in failing hearts. Therefore, targeting the expression and function of the SERCA2a-PLB system by novel gene therapeutic approaches is currently a hot topic in cardiovascular research. In the present work different adenovirale (AdV) and adeno-associated-virus-(AAV) vectors expressing PLN-shRNAs in cardiomyocytes were constructed and tested for their silencing PLN potential. The ultimate goal of this RNA interference approaches was to develop a strategy for improving the Ca2+-transporting activity of the SR Ca2+ pump in settings of heart failure. Initially an almost complete PLN gene silencing could be achieved in primary neonatale rat cardiomyocytes (CM) using the adenovirale vector AdshPLNr. Already with a low vector dose a clear decline of the PLN mRNA expression was observed which was linked to subsequent suppressed PLN protein expression. The silencing affect of this PLN-shRNA was highly specific as verified by the unchanged protein level of other proteins involved in cardiac Ca2+ regulation. The functional consequence of PLN silencing was an increase Ca2+ - affinity of the SR Ca2+ ATPase. In order to use PLN-shRNA for treatment in chronic heart failure in animal models different self complementary (sc) AAV6-vector constructs with distinct heart muscle cell tropism were developed. A systematic characterization of these constructs in cell cultures showed a high silencing effectiveness. It was also found that inclusion of an additional polymerase II promoter-depending GFP expression cassette into the viral vector genome reduced both the expression of shPLNr and the silencing efficacy of the respective vector. One out of three extensively characterized scAAV-shPLNr vectors turned out to exhibit the most effective PLN silencing activity. The genomic length of this vector was approx. 1 kb. It did not contain other expression cassettes. The degree of reduction of PLN mRNA levels in cultures neonatal rat cardiomyocytes caused by this vector was similar to the previously characterized AdshPLNr vector. In addition, the PLN-shRNA expressing vector genome was also packed into an AAV9 capsid. The therapeutic potential of the latter vector was examined in settings of experimental chronic heart failure due to pressure-overload heart hypertrophy in rats. Hemodynamic, echocardiographic as well as morphological examinations in this model revealed for the first time that PLN gene silencing after treatment with scAAV-shPLNr - but also with either AdshPLNr - improved the contractile dysfunctions of the hypertrophied rat hearts and prolonged the survival time of the animals with pressure-overload heart hypertrophy. Furthermore, the applied viral vectors apparently modulated the expression levels of certain microRNAs linked to pathological cardiac hypertrophy. They caused a normalization of the microRNA expression level in comparison to hypertrophied CM controls. Thus, this work shows that the investigated scAAV-vector-based RNA-interference technology is a novel and promising gene therapeutic approach for the treatment of chronic heart failure.