Die vH+-ATPase und ihre Bedeutung für die pH-Regulation bei ovinen Pansenepithelzellen

Abstract

Die hohe Sekretions- und Resorptionsleistung des Pansenepithels der Wiederkäuer ist an die Existenz aktiver Transportmechanismen geknüpft. In diesem Zusammenhang konnte kürzlich nachgewiesen werden, dass bei ovinen ruminalen Epithelzellen neben der Na+/K+-ATPase eine H+-ATPase vom vakuolären Typ (vH+-ATPase) exprimiert wird. Ziel der hier vorliegenden Untersuchungen war es daher, die funktionelle Bedeutung der vH+-ATPase für die Aufrechterhaltung des intrazellulären pH-Wertes (pHi) aufzuklären und Faktoren zu identifizieren, welche die Aktivität der vH+-ATPase bestimmen. Zu diesem Zweck wurden fluoreszenzspektroskopische Messungen an primärkultivierten, mit dem pH-sensitiven Farbstoff BCECF beladenen und in CO2/HCO3--freien Medien inkubierten Pansenepithelzellen (PEZ) des Schafes durchgeführt. Die Abgrenzung von vH+-ATPase- und Na+/H+-Austauscher (NHE)-Aktivität erfolgte mittels spezifischer Inhibitoren (Foliomycin, HOE694, S3226). Die experimentellen Arbeiten führten zu folgenden Ergebnissen: 1\. Im HEPES-gepufferten Na+-Medium lag der pHi ruminaler PEZ bei 7,43 ± 0,22. Durch die Anwesenheit von 20 mmol/l Buttersäure im extrazellulären Medium wurde er auf 7,02 ± 0,12 erniedrigt. Die intrazelluläre Ansäuerung induzierte eine pHi-Erholung von 0,57 ± 0,05 pH- Einheiten/10min. 2\. Der Einsatz des vH+-ATPase-spezifischen Inhibitors Foliomycin (2 µmol/l) bewirkte in beiden Medien eine Absenkung des pHi-Wertes um etwa 0,2 pH-Einheiten und führte zu einer Reduktion der Butyrat-induzierten pHi-Erholung. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine funktionelle und quantitativ bedeutsame vH+-ATPase-Aktivität bei ovinen PEZ. 3\. Wurden zusätzlich zum Foliomycin spezifische Hemmstoffe der Subtypen 1 (HOE694) und 3 (S3226) des NHE appliziert, kam es zu einer Verstärkung der Effekte auf den pHi (-0,64 ± 0,2 pH-Einheiten) und auf die pHi-Erholung (-0,2 ± 0,1 pH- Einheiten/10 min). 4\. Auf der Basis der durchgeführten Inhibitorstudien kann festgestellt werden, dass unter nominell HCO3--freien Bedingungen die vH +-ATPase-Aktivität zu etwa 30 % und die NHE1- bzw. die NHE3-Aktivität zu etwa 50 und 20 % zur Einstellung des pHi der PEZ beitragen. 5\. Die Ergebnisse bestätigten die dominante Rolle des NHE1 für die pHi-Erholung nach einem Säureload unter HCO3--freien Bedingungen. 6\. Inkubation von PEZ in einem Medium mit einer von 136 mmol/l auf 36 mmol/l reduzierten Chlorid- Konzentration führte zu einer signifikanten Erniedrigung des pHi (-0,51 ± 0,03 pH-Einheiten) sowie der Butyrat-induzierten pHi-Erholung von 0,57 ± 0,04 auf 0,38 ± 0,05 pH-Einheiten/10 min. Darüber hinaus waren die hemmenden Foliomycin-Effekte nicht mehr nachweisbar und die HOE694- bzw. S3226-sensitiven Komponenten des pHi vermindert. 7\. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die extrazelluläre [Cl-] über bisher unbekannte Mechanismen Einfluss auf die funktionelle Aktivität dieser wesentlichen H+-sezernierenden Mechanismen (vH+-ATPase, NHE) nimmt. Die Chlorid-Abhängigkeit des ruminalen NHE wurde erstmalig gezeigt.

The secretory and absorptive functions of the ruminal epithelium in ruminants depend on the existence of active transport mechanisms. In this context, it was recently confirmed that a vacuolar type H+-ATPase (vH+-ATPase) is expressed besides the Na+/K+-ATPase in ovine ruminal epithelial cells. Therefore, the aim of this work was to determine the functional importance of the vH+-ATPase for maintaining the intracellular pH (pHi) as well as to identify some factors which regulate vH+-ATPase activity. We conducted spectrofluorometrical measurements on sheep ruminal epithelial cells (REC), which were incubated in nominally CO2/HCO3--free media and loaded with the pH- sensitive dye BCECF. The contribution of vH+-ATPase and Na+/H+-exchanger (NHE) subtype 1 and 3 activity to the regulation of pHi was determined by using selective inhibitors (foliomycin, HOE694, S3226). Our experiments delivered the following results: 1\. The initial pHi of REC was 7.43 ± 0.22 in HEPES- buffered NaCl medium and 7.02 ± 0.12 after acid loading with 20mM butyrate. The acidification induced by butyrate was followed by a pHi recovery that amounted to 0.57 ± 0.05 pH-units per 10 min. 2\. Using the selective H+-ATPase inhibitor foliomycin (2µM) caused a reduction of pHi in both media by roughly 0.2 pH-units and also lead to a reduced butyrate-induced pHi recovery. The present results clearly demonstrate a functionally and quantitatively important vH+-ATPase activity in ovine REC. 3\. Specific inhibitors of the NHE subtype 1 (HOE694) and of the NHE subtype 3 (S3226) were applied in addition to foliomycin. This reinforced the effects on the pHi (-0.64 ± 0.2 pH-units) as well as on the pHi-recovery (-0.2 ± 0.1 pH-units/10 min). 4\. On the basis of the inhibitor studies that we conducted, we found under nominally HCO3-- free conditions that vH+-ATPase activity contributes for about 30 %, NHE1 for about 50% and NHE3 for about 20% on H+ extrusion in REC. 5\. These results confirm the dominant role of NHE1 for the pHi-recovery after an acid load under HCO3--free conditions. 6\. Incubation of REC in a medium with a reduced extracellular Cl--concentration (36 mM instead of 136 mM) led to a significant reduction of pHi (-0.51 ± 0.03 pH-units) as well as of the butyrate-induced pHi recovery (0.38 ± 0.05 instead of 0.57 ± 0.04 pH-units/10 min). Moreover, the inhibitory effect of Foliomycin was abolished and the parts of pHi sensitive to HOE694 and S3226 were smaller in the solution with reduced [Cl-]. 7\. These findings show the fact that the extracellular [Cl-] influences the functional activity of important H+-excreting mechanisms (vH+-ATPase, NHE) via hitherto unknown ways. An influence of [Cl-]e on the NHE activity in REC was first shown in this study.