Evolutionary implications of artificial night-time lighting for the mosquito Culex pipiens: insights from genetics, physiology, behaviour and population structure

Abstract

Summary The term urbanisation describes, on the one hand, the process of outward expansion of cities and on the other hand a changed behaviour of rural populations, i.e. functional urbanisation. Especially the physical expansion of cities creates increasing pressure on the surrounding environments and its plant and animal communities. To date, there are 32 Megacities (>10 million inhabitants) around the globe, 11 of them with more than 20 million inhabitants. As a habitat, cities are quite challenging as they are highly dynamic, crowded, noisy, polluted and extremely patchy in terms of comparable habitat types or local temperature. One important feature accompanying the majority of human settlements is artificial light at night. In fact, its presence became as natural to us as the moon and stars. However, light itself is a stimulus to above-ground species that regulates timekeeping, daily activity and seasonal behaviours. Consequently, light could potentially impact a given organism on an array of levels, for example genetically or behaviourally, but also over different time scales, for instance daily or seasonally. In order to assess the effects of artificial light at night I analysed different levels, i.e. gene expression, activity, fecundity and population structure, in one species, the common house mosquito Culex pipiens. In the first chapter of my thesis I examined the transcriptome, which is the entirety of the transcribed genes at a given moment in time, of male and female mosquitoes after exposure to different light regimes (1. “control”: light:16h and dark:8h; 2. “twilight” light:16+3h and dark:5h). I found that gene expression between males and females differed by more than 50%, independent of the light treatment. This underlines the importance of studying both sexes separately, rather than pooling the data, in order to avoid under- or overestimation of the effect of artificial light arising by opposing or additive patterns of sex-specific gene expression. The extended light treatment elicited a reduction in the expression of genes related to gametogenesis, immune response and lipid metabolism in males but not in females. I then specifically analysed the gene expression of 5 genes (period, timeless, clock, cycle and cryptochrome-2) comprising most of the central circadian clock using qRT-PCR. The photoreceptor CRYPTOCHROME-1, another clock component, picks up blue light and feeds the information, via a reaction cascade, into the clock, which results in daily fine-tuning. Therefore, information obtained from ambient light levels should lead to a shift in expression levels in the extended light treatment (light:dark: 16+3:8h). I indeed found a down-regulation of the period and the clock gene expression in the light treatment. When analysing this for each sex separately, I found the same expression pattern in males. However, in females expression of the period gene was down-regulated while the cycle gene expression was up-regulated. There was a clear difference in expression, even though I did not find evidence for an overall shift in the clock timing compared to the baseline group. The circadian clock regulates a number of downstream processes, daily activity being one of them. A change in timekeeping should thus be reflected in daily locomotor activity. This was tested using a Locomotor Activity Monitor, which records activity as the number of crossings of infra red beams in a given time interval. Males and females displayed very different movement patterns, with males being less active than females. The extended light period significantly reduced activity in both sexes throughout the day, not only at the time of application. In constant darkness, the individuals resumed a similar activity pattern, i.e. active phases, indicating that the clock rhythm (~24h) was not shifted, even though the magnitude of activity was reduced. To understand if less activity in the light treatment had implications for the population I analysed female fecundity as the number and size of eggs produced per population. Less active individuals may have less time for feeding and thus the nutritional status may not be optimal. Optimising reproductive output could then be achieved by producing either fewer eggs of the same size (as in optimal conditions) or the same number but smaller eggs. I found fewer and smaller eggs per raft in the light treatment, indicating that light may have effects on the population level as well. The next step was to evaluate whether the presence of artificial light leads to a detectable differentiation between natural urban and rural populations. A microsatellite analysis was conducted to estimate the degree of differentiation along an urban-rural gradient. Unexpectedly, there was no differentiation. Instead there was a high connectivity between local populations ensuring gene flow and thus a high genetic variability in a panmictic population across the study area. In this thesis, I was able to show that artificial light at night does influence mosquitoes on several levels. Light can be a stressor potentially influencing adult individual fitness. Additionally, the fitness of the offspring might be negatively impacted. On the other hand, the high amount of genetic variability and potential exchange of rural and urban local populations ensures a large gene pool and a high adaptive potential. To date, this is the only work addressing the impact of artificial light at night on several levels. It therefore presents important information on potential influences of light pollution. Furthermore, valuable insights on mosquito ecology, especially in males, have been gained, which may be of great interest for estimating the success of control programs.

Urbanisierung beschreibt die physische Expansion von Städten einerseits, zum Anderen aber auch das zunehmend verstädterte Verhalten von Bewohnern kleinerer, ruraler Ortschaften. Dieser Vorgang wird als funktionelle Urbanisierung bezeichnet. Insbesondere die Ausdehnung von Städten sorgt für steigenden Druck auf Flora und Fauna der umgebenden Landschaft. So gibt es bis heute 32 Megastädte (> 10 Millionen Einwohner), 11 davon haben bereits mehr als 20 Millionen Einwohner. Als Habitat sind Städte eine Herausforderung da sie hoch-dynamisch, überfüllt, laut und verschmutzt sind. Vergleichbare Habitat Typen sind sehr ungleichmäßig über Stadt verteilt, vor allem auch in Bezug auf lokal vorherrschende Temperaturen. Ein weiteres Merkmal urbaner Lebensräume ist künstliches Licht in der Nacht. Tatsächlich ist künstliches Licht für uns so alltäglich geworden wie Mond und Sterne. Nichtsdestotrotz, Licht als solches ist ein wichtiger Stimulus für überirdische Lebewesen, der Zeiterfassung sowie tägliche und saisonale Aktivität reguliert. Dies verdeutlicht, das Licht einen Organismus möglicherweise auf einer ganzen Reihe von Ebenen beeinflussen könnte, zum Beispiel genetisch oder verhaltensbiologisch, aber auch über Zeiträume hinweg, etwa im Tages- oder Jahresverlauf. Um den Einfluss künstlichen Lichts bewerten zu können, analysierte ich unterschiedliche Ebenen innerhalb einer Stechmückenart, der gemeinen Hausmücke (Culex pipiens). Im ersten Teil dieser Arbeit untersuchte ich das Transkriptom, die Gesamtheit der Gentranskripte zu einem bestimmten Zeitpunkt, von männlichen und weiblichen Stechmücken nachdem sie unterschiedlichen Lichtregimes (1. „control“ Licht: 16 Std. und dunkel:8 Std.; 2. „twilight“ Licht: 16+3 Std. und Dunkel: 8 Std.) ausgesetzt waren. Mehr als 50% der Gene wurden allein beim Vergleich von Männchen mit Weibchen unterschiedlich exprimiert. Ein Befund, der die Wichtigkeit unterstreicht, beide Geschlechter getrennt zu untersuchen, anstatt die Genexpression aller Tiere gemeinsam zu betrachten. Nur so lässt sich vermeiden, dass aufgrund von gegensätzlichen oder additiven geschlechtsspezifischen Genexpressionsmustern die Auswirkungen künstlichen Lichtes unter- oder überschätzt werden. Des Weiteren verursachte die verlängerte Lichtperiode eine Reduktion der Expression von Genen, die in der Gametogenese, der Immunreaktion und im Fettstoffwechsel involviert sind in Männchen, jedoch nicht in Weibchen. Danach untersuchte ich mittels qRT-PCR speziell die Expression von 5 Genen (period, timeless, clock, cycle und cryptochrome-2) der zentralen, circadianen Uhr. Der Fotorezeptor CRYPTOCHROME-1 nimmt Photonen blauer Wellenlängen auf und setzt so eine Reaktionskaskade in Gang. Auf diesem Weg gelangen Informationen zur Tageszeit zum zentralen Uhr-Mechanismus, was für dessen Feineinstellung sorgt. Eine Veränderung des Lichtregimes, wie im durchgeführten Versuch, sollte also einer Veränderung der Genexpression führen. Tatsächlich fand eine Herunterregulierung der Genexpression von period und clock bei verlängerter Hellphase statt. Bei der Untersuchung nach Geschlechtern getrennt fand sich das gleiche Expressionsmuster bei Männchen. Bei den Weibchen wurde das period- Gen ebenfalls herunter- das cycle-Gen jedoch heraufreguliert. Obwohl es insgesamt klare Unterschiede in der Genexpression zwischen Mücken beider Lichtregimes gab, konnte ich keinen Hinweis auf eine allgemeine Verschiebung des circadianen Rhythmus finden. Die innere Uhr reguliert die Funktion einiger nachgeschalteter Prozesse, tägliche Aktivität ist einer davon. Unterschiede in der Zeiterfassung sollten daher in divergierenden täglichen Bewegungsmustern resultieren. Dies wurde mit Hilfe von einem Locomotor Activity Monitor getestet. Dieses Gerät zählt die Anzahl der Durchtritte durch Infrarot Schranken in einem gegebenen Zeitintervall. Männchen und Weibchen zeigten sehr unterschiedliche Aktivitätsmuster, die Männchen waren generell weniger aktiv. Bei verlängerter Hellphase war die Aktivität beider Geschlechter über den ganzen Tag hinweg signifikant reduziert, nicht nur in der Phase, in der Licht appliziert wurde. In ständiger Dunkelheit zeigten die Individuen beider Gruppen ähnliche Aktivitätsmuster, d. H. ähnlich lange Phasen der Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass der Rhythmus der Uhr (ca. 24h) nicht verändert war, obwohl das Ausmaß der Aktivität reduziert war. Um zu verstehen, ob reduzierte Aktivität Auswirkungen für die gesamte Population hat untersuchte ich die Fekundität der Weibchen anhand der Anzahl und Größe der Eier pro Population in beiden Lichtregime-Gruppen. Weniger aktive Individuen könnten weniger Zeit zur Nahrungsaufnahme haben und somit einen schlechteren Ernährungszustand. Im Falle einer optimierten Nachkommen-Produktion könnte das wiederum entweder zu weniger aber gleich großen Eiern pro Eischiffchen führen, oder aber zu kleineren Eiern, die aber ähnlich zahlreich sind wie bei gutem Ernährungszustand. Ich fand heraus, dass im Lichtversuch die Anzahl der Eier pro Schiffchen geringer war. Gleichzeitig waren die Eier aber ebenfalls kleiner. Dies deutet darauf hin, dass künstliches Licht auch Auswirkungen auf Populationsebene haben könnte. Somit war der nächste Schritt zu evaluieren, ob die Präsenz künstlichen Lichts zu detektierbarer Differenzierung zwischen natürlichen urbanen und ruralen Populationen führt. Mittels einer Mikrosatelliten-Analyse wurde der Grad der Differenzierung entlang eines urban-rural Gradienten bestimmt. Entgegen den Erwartungen konnte keine Differenzierung gefunden werden. Stattdessen scheint eine hohe Konnektivität zwischen lokalen Populationen zu bestehen, die dann Genfluss und somit eine hohe genetische Variabilität in einer panmiktischen Population über das ganze Untersuchungsgebiet sichert.