In vitro- und ex vivo- Untersuchungen zur Zytokinexpression im equinen Trachealepithel

Abstract

In dieser Arbeit wurden in vitro- und ex vivo- Untersuchungen zu viralen Infektionen des Trachealepithels des Pferdes und der dadurch ausgelösten Zytokinexpression durchgeführt. Hauptuntersuchungsgegenstand war eine im Institut für Veterinär-Pathologie etablierte Zellkultur aus equinem Trachealepithel (ET Zellen). Die ET Zellen wurden mit den equinen Herpesviren vom Typ 1, 2 und 4 (EHV-1, -2, -4), den equinen Rhinitisviren Perv und 350/72 (equines Rhinitis A Virus: ERAV) und P 1436/73 (equines Rhinitis B Virus: ERBV) sowie mit dem Vesikulären Stomatitisvirus (VSV) und dem Erreger der equinen Arteriitis (EAV) infiziert. Nach Erstinfektion wurden die Zellen zweimal passagiert und es wurden Wachstumskurven für diese Viren erstellt. Außer EHV-4 führten alle verwendeten Viren zu einer produktiven Infektion der ET Zellen. Für ERAV und ERBV ist damit bewiesen, auch die unteren Luftwege des Pferdes zu infizieren und pathogene Mechanismen auslösen zu können. Weiterhin ist die Vermutung über die Bedeutung von EHV-2 für respiratorische Erkrankungen des Pferdes untermauert worden. Interessanterweise kam es für EHV-4, den typischen Erreger der Rhinopneumonitis beim Pferd, nicht zu einer produktiven Infektion der ET Zellen. Möglicherweise handelt es sich um eine restringiert-persistente Infektion, dies muß in weiteren Untersuchungen erforscht werden. Anschließend wurde die Zytokinexpression durch die ET Zellen vor und nach Infektion mit EHV-1, -2, -4 sowie beiden Stämmen der ERAV bestimmt. Dazu wurde nach RNA Isolierung und darauffolgender Umschreibung in cDNA die erhaltene cDNA mit Hilfe zytokinspezifischer Primer vervielfältigt (RT-PCR). Es wurden die Primer für equines Interleukin (IL) -1a, -1b, -2, -4, -5, -6, -8, -10, -11, -13, Tumornekrosefaktor a (TNFa), Interferon g (IFNg) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonienstimulierender Faktor (GM-CSF) verwendet. Für die ET Zellen wurde eine Zytokinexpression für IL-1a, -1b, -6, -8, -10 und -11 nachgewiesen. Alle Zytokine wurden schon vor Infektion exprimiert. Nach viraler Infektion konnten Änderungen der Zytokinexpression beobachtet werden. Als ein wichtiges Ergebnis stellte sich heraus, daß beide ERAV deutlich die Zytokinexpression für IL-11 erhöhten. Bei der angewandten RT-PCR handelt es sich um einen qualitativen Nachweis, in weiteren Untersuchungen sollten zur besseren Auswertung auch quantitative Methoden zum Einsatz kommen. Um Aussagen über das Zytokinspektrum in den unteren Atemwegen der Pferde zu erhalten, wurden weiterhin von 15 Schlachtpferden Zellproben durch Abschaben der Trachea und ihrer Bifurkation mit dem Skalpell gewonnen. Dafür wurden Tracheen von Lungen ohne makroskopisch sichtbare pathologische Veränderungen ausgewählt. Es konnte mRNA für IL-8 (100% der Pferde), IL-2 (67%), IL-1b, -6, -10 (60%), IFNg (53%), IL-1a (20%) sowie für IL-11, TNFa und GM-CSF (13%) nachgewiesen werden. mRNA für IL-4, -5 und -13, welche kennzeichnend für Th2-Lymphozyten sind, konnte bei keinem der Pferde festgestellt werden. Das Vorkommen von IL-2 und IFNg bei einem Großteil der Pferde sowie das Fehlen von IL-4, -5 und -13 zeigen, daß bei Pferden ohne morphologische Veränderungen im Epithel der unteren Atemwege eine Th1-Immunlage vorzuherrschen scheint. Die Zellen von vier Pferden wurden nach der Gewinnung sofort mit EHV-1, -2 und -4 sowie mit den equinen Rhinitisviren infiziert. Hier zeigte sich interessanterweise, daß schon die Kultivierung der Zellen allein zu Änderungen in der Zytokinexpression führte. Aussagen über Änderungen der Zytokinexpression nach Infektion konnten ohne Quantifizierung nicht getroffen werden. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, daß dem equinen Trachealepithel aus immunologischer Sicht große Bedeutung für die Pathogenese respiratorischer Erkrankungen zugeschrieben werden kann und es Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten werden sollte.

These studies were undertaken to explore the role of viral infection of the equine tracheal epithelium and virally induced cytokine expression. The main target was a cell culture obtained from equine tracheal epithelial cells (ET cells). The ET cell line was established in the institute for veterinary pathology. It is the second permanent cell line of equines achieved worldwide. ET cells were infected with equine herpesvirus type 1, 2 and 4 (EHV-1, -2, -4); equine rhinitis virus serotype A (strains Perv and 350/72) and serotype B (strain P 1436/73); vesicular stomatitis virus and with equine arteritis virus. After primary infection, the cells were passaged two times and growth kinetics were evaluated for all viruses. All viruses (except EHV-4) led to productive infection of ET cells. These findings confirm the ability of equine rhinitisviruses to infect the lower airways which should be investigated in following studies. Additionally, the results provide further evidence of the infectious potential of EHV-2 as a respiratory pathogen for the lower airways of the horse. Interestingly EHV-4 was not able to set up a productive infection cycle in ET cells. We presumed a restricted persistent infection which should be subject to further investigation. Virally induced expression of cytokines was determined by using the reverse transcription-polymerse chain reaction (RT-PCR). Total cellular RNA was extracted from ET cells, reverse transcripted in cDNA and amplified with cytokine specific primers for equine interleukin (IL) 1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 11, 13, interferon gamma (IFNg), tumour necrosis factor alpha (TNFa) and granulocyte-macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF). ET cells expressed mRNA for IL 1a, 1b, 6, 8, 10 and 11. All cytokines could already be measured before infection, but viral infection led to changes in cytokine expression. An important result in this context is, that both equine rhinitis A viruses increased expression for IL 11. In following studies the use of RT-PCR should be combined with quantitative methods. To evaluate cytokine expression in the tracheal epithelium of the horse, tracheal tissue of 15 slaughtered horses without morphological changes in trachea and lungs were sampled. Cells were obtained by gentle scraping off the tracheal epithelium layer with a scalpel. mRNA for equine IL 8 (100% of the horses), IL 2 (67%), IL 1b, 6, 10 (60%), IFNg (53%), IL 1a (20%) and for IL 11, TNFa and GM-CSF (13%) could be detected. mRNA for IL 4, 5 and 13, which are characteristic for an immunreaction of the th2 phenotype was not found in any horse. In contrast, expression of mRNA for IL 2 and IFNg was present in most of the horses. This and the missing IL 4, 5 and 13 detection indicates a th1 phenotype in the tracheal epithelium of horses without morphological changes. Cells of four horses were infected immediately after scraping with EHV-1, -2 and -4 and with equine rhinitis viruses. Interestingly, culturing of cells alone led to changes in cytokine expression. Viral influence of cytokine expression could not be evaluated because of the lack of quantitative measurement. This work shows that the equine tracheal epithelium apparently plays a central role in immunological reactions in the pathogenesis of respiratory