Molekulare Mechanismen der p16-vermittelten Anoikisinduktion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen

Abstract

In über 90% humaner Pankreaskarzinome sind sowohl die funktionelle Inaktivierung des Zellzyklus-Inhibitors p16INK4a (p16) als auch eine konstitutive Aktivierung von Kirsten-Ras (K-Ras) nachweisbar. Unsere Voruntersuchungen zeigten eine Restitution der Sensitivität für Anoikis durch p16-Reexpression in humanen Pankreaskarzinom-Zellen, so dass die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen dieser möglicherweise therapeutisch relevanten Reversion in der vorliegenden Arbeit zu untersuchen waren. Am Modell der humanen Pankreaskarzinom-Zelllinie Capan-1 konnte eine essentielle Funktion von onkogenem K-Ras für die Anoikisresistenz der Tumorzellen sowie eine Beteiligung von Caspase-8 an der p16-vermittelten Anoikis belegt werden. Capan-1 Pankreaskarzinom-Zellen exprimierten überwiegend die K-Ras Isoform, auf die auch die detektierbare Ras-Aktivität zurückgeführt werden konnte. Kultivierung der Zellen in Suspension führte zu einem ausgeprägten Anstieg der K-Ras Aktivität. Interessanterweise wiesen Capan-1 Klone mit stabiler p16-Reexpression nicht nur einen vollständigen Verlust der K-Ras Aktivität sowohl unter adhärenten als auch unter Suspensionsbedingungen, sondern auch eine ausgeprägte Reduktion des zellulären K-Ras Gehaltes im Vergleich zu Kontrollzellen auf. Die Verringerung der Ras-Expression von Capan-1 Zellen mit K-rasV12 Antisense Oligonukleotiden führte zu einer erhöhten Anoikisrate, während umgekehrt die Restitution von onkogenem K-Ras in Capan-1/p16 Zellen deren Anoikisfraktion wieder stark reduzierte. Dabei wurde die durch p16-Reexpression verringerte Fähigkeit von Capan-1 Zellen, Kolonien in Soft- Agar zu bilden, durch die stabile Expression von onkogenem K-Ras wiederhergestellt. Der Verlust der Tumorigenität von Capan-1/p16 Zellen in Nacktmäusen blieb jedoch trotz K-Ras Substitution bestehen. Die p16-bedingte K-Ras Regulation zeigte sich statt auf transkriptioneller Ebene in verringerter Proteinstabilität der Ras-Isoform, wahrscheinlich durch eine direkte Assoziation mit p16 und infolgedessen beschleunigten Abbau. Eine Regulation von K-Ras durch p16 in einer weiteren Pankreaskarzinom- und einer Kolonkarzinom-Zelllinie lässt dahinter ein generelles Prinzip vermuten. Die bisherigen Beobachtungen belegen erstmalig eine funktionell relevante Regulation des Onkoproteins K-Ras durch den Tumorsuppressor p16 und charakterisieren die K-Ras Inhibition als notwendiges Ereignis im Kontext der p16 vermittelten Anoikis. Diese neue, funktionelle Interaktion der beiden häufigsten genetischen Alterationen im humanen Pankreaskarzinom bestimmt wahrscheinlich durch das zentrale tumorbiologische Phänomen der Anoikisresistenz den typischen aggressiven Krankheitsverlauf.

Over 90% of pancreatic carcinomas exhibit functional inactivation of the cell cycle inhibitor p16INK4a (p16) as well as constitutive activation of Kirsten- Ras (K-Ras). Our previous studies showed a restitution of sensitivity to anoikis by reexpression of p16 in human pancreatic cancer cells so that the basic molecular mechanisms of this possibly therapeutic relevant reversion were to be elucidated in the present thesis work. Exemplary in the human pancreatic carcinoma cell line Capan-1 an essential function of oncogenic K-Ras for anoikis resistance and a participation of Caspase-8 in p16 mediated anoikis was given evidence. Capan-1 pancreatic carcinoma cells mainly express the K-Ras isoform to which all detected Ras activity could be attributed. Cultivating cells in suspension led to a marked increase in K-Ras activity. Interestingly, Capan-1 clones with stable reexpression of p16 exhibited not only a complete loss of K-Ras activity under adhesive as well as suspension conditions, but also a pronounced decrease in the cellular K-Ras content as compared with control cells. Reduction of Ras expression in Capan-1 cells with K-rasV12 antisense oligonucleotides led to an increased rate of anoikis, whilst vice-versa restitution of oncogenic K-ras in Capan-1/p16 cells highly reduced their anoikis fraction. Besides, the ability of Capan-1 cells to form colonies in soft agar, reduced by p16 reexpression, was restored by stable expression of oncogenic K-ras. The Capan-1/p16 acquired loss of tumorigenicity in nude mice, however, remained in spite of K-Ras substitution. In place of the transcriptional level, p16 mediated regulation of K-Ras expression was disclosed in lowered protein stability of the Ras isoform, probably by direct association with p16 and consequently accelerated degradation. The regulation of K-Ras by p16 in a second pancreatic carcinoma cell line and a colon carcinoma cell line points to an underlying general principle. These observations document a functional relevant regulation of the oncoprotein K-Ras by the tumorsuppressor p16 for the first time and characterize the inhibition of K-Ras as an essential event in the context of p16 mediated anoikis. This new, functional interaction of the most prominent genetic alterations in human pancreatic carcinoma probably determines the typical aggressive progress of the disease by the central tumorbiological phenomenon of anoikis resistance.