Generation of an infectious clone of Duck Enteritis Virus (DEV): a basis for pathogenesis studies and vectored vaccine development

Abstract

This study focused on the construction of an infectious bacterial artificial chromosome (BAC) clone of duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and efficient generation of a vectored DEV vaccine expressing hemagglutinin (H5) of high pathogenicity H5N1 avian influenza virus (AIV) based on this infectious clone. Subsequently, the whole genome sequences of DEV strain 2085 were determined and compared with the whole genome of DEV VAC strain and sequences of DEV Clone-03 and CHv. For construction of the DEV infectious clone, the mini-F vector sequences were inserted into the genome of DEV strain 2085 by homologous recombination in lieu of the UL44 (gC) gene. DNA of the resulting in recombinant virus v2085-GFPΔgC was electroporated into Escherichia coli strain Megax and subsequently strain GS1783, and a full-length DEV BAC clone (p2085) was recovered. Transfection of p2085 into chicken embryo cells resulted in DEV-specific plaques exhibiting green autofluorescence under UV excitation, indicating the successful generation of an infectious clone of DEV strain 2085. A gC-negative mutant, v2085ΔgC, was generated by deleting mini-F vector sequences by using Cre-Lox recombination, and a revertant virus v2085ΔgC-R was generated by co-transfection of p2085 with UL44 sequences produced through PCR. Finally, AIV H5 sequences were inserted into p2085 to generate a vectored DEV recombinant virus for expressing of H5, and high-level H5 expression of the v2085_H5 virus was detected by indirect immunofluorescence and western blotting. Plaque size determination showed that the sizes of v2085ΔgC plaques were significantly bigger (12%) over those of parental 2085 virus or the v2085ΔgC-R revertant virus (ANOVA, P<0.05), while plaque areas of v2085_H5 or v2085-GFPΔgC were significantly decreased. No significant difference was observed between parental or revertant DEV and mutant or recombinant DEV with respect to virus titers determined after trypsinization titration of infected cells, while virus titers of infectedcell supernatants revealed significant reductions in case of the gC-negative viruses of more than 700-fold when compared to parental 2085 or v2085ΔgC-R. Cell-associated virus titers of gCnegative DEV also showed significant reduction of 50-500-fold than parental 2085 or revertant DEV (ANOVA, P<0.05). The nucleotide sequence was derived from the 2085 genome cloned as an infectious bacterial artificial chromosome (BAC) clone. The DEV 2085 genome is 160,649 bp in length and encodes 78 predicted open reading frames (ORFs)(GenBank ID: JF999965), a number identical to that of the attenuated DEV VAC strain (GenBank ID: EU082088.2). Comparison of the genome sequences DEV 2085 and VAC with partial sequences of the virulent CHv strain and the attenuated strain Clone-03 was carried out to identify nucleotide or amino acid polymorphisms that potentially contribute to DEV virulence. No amino acid changes were identified in 24 of the 78 ORFs, a result indicating high conservation in DEV independently of strain origin or virulence. In addition, 39 ORFs showed only non-synonymous nucleotide substitutions. The remaining 15 ORFs had fragment insertion or deletions, frame-shift mutations or non- synonymous nucleotide substitutions with an effect on ORF initiation or termination. In 7 of the 15 ORFs with high and 27 of the 39 ORFs with low variability, polymorphisms were exclusively found in DEV 2085, a finding that likely is a result of a different origin of this strain (Europe) and the three other strains (Eastern Asia). Five ORFs (UL2, UL12, US10, UL47 and UL41) with polymorphisms were identical between the virulent DEV 2085 and CHv but different from VAC or Clone-03, and may, individually or in combination, represent DEV virulence factors. We conclude that (1) absence of DEV gC results in increased plaque sizes in vitro, (2) gC plays a role in DEV egress, and (3) generation of an infectious DEV clone allows rapid generation of vectored vaccines, (4) DEV 2085 may represent an origin of Europe other than DEV VAC, Clone-03 and CHv of Eastern Asian, (5) UL2, UL12, US10, UL47 and UL41 may be related to virulence of DEV.

Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Konstruktion eines infektiösen Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Klons des Duck Enteritis Virus (DEV) Stammes 2085. Dieser infektiöse Klon ermöglichte die Generierung eines Vektor- basierten DEV-Impfstoffes, welcher das Hämagglutinin (H5) eines hochpathogenen H5N1 aviären Influenzavirus (AIV) exprimiert. Im Anschluß wurde die gesamte Genomsequenz des DEV-Stammes 2085 bestimmt und mit dem Genom der DEV-Stämme VAC, Clone-03 und CHv verglichen. Für die Konstruktion des infektiösen Klons wurde eine Mini-F-Vektorsequenz mittels homologer Rekombination an Stelle des UL44 (gC) Gens in das Genom des Stammes 2085 eingebracht. Die DNA des daraus resultierenden rekombinanten Virus wurde in den Escherichia coli-Stamm MegaX eingebracht und daraus resultierende Klone analysiert. Derr korrekte DEV-BAC- Klon (p2085) wurde für spätere Mutagenese in den E. coli-Stamm GS1783 elektroporiert. Die Transfektion von Hühner-Embryofibroblasten mit p2085 führte zu DEV-spezifischen Plaques, die nach UV-Anregung grüne Autofluoreszenz aufwiesen, Dies ließ auf eine erfolgreiche Generierung eines infektiösen Klons des DEV Stammes 2085 schließen. Eine gC-negative Mutante wurde durch Deletion der Mini-F-Sequenzen mithilfe des Cre-Lox Rekombination genriert. Zudem wurde eine Virus-Revertante durch Ko-Transfektion von p2085 mit einem PCR-Produkt, das UL44-Sequenzen enthielt, erzeugt. Schließlich wurden H5-Sequenzen in p2085 eingebracht, um ein rekombinantes Virus herzustellen, welches das Hauptimmunogen des AIV exprimiert. Eine robuste Expression von H5 in mit der Rekombinante infizierten Zellen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz sowie Western Blot nachgewiesen. Plaque-Größenbestimmungen zeigten, dass die Plaque- Größen von der gC-negativen Mutante signifikant größer (12%) waren als die des Parentalvirus 2085 oder der Revertanten (ANOVA, P<0,05), während die Plaquegrößen von der Fremdgene (H5 oder GFP) exprimierten, signifikant reduziert waren. Zwischen den DEVMutanten und parentalem oder revertantem DEV wurden keine signifikanten Unterschiede in den intrazellulär vorhandenen Virustitern bestimmt. Dagegen ließen Virustiter der Überstände infizierter Zellen eine signifikante Abnahme um mehr als das 700-fache im Falle des gCnegativen Viruses im Vergleich mit parentalem 2085 Virus erkennen. Zell- assoziierte Virustiter des gC-negativen DEV zeigten ebenfalls eine signifikante Abnahme um das 50- bis 500-fache gegenüber dem Elternvirus (ANOVA, P<0,05). Des Weiteren wurde das Genom der 2085 Stammes anhand des generierten BAC sequenziert. Das 2085-Genom ist 160.600 bp lang und kodiert für 78 offene Leserahmen (ORFs) (GenBank ID: 999965), eine Anzahl, die mit der des attenuierten DEV VAC-Stammes identisch ist (GenBank ID: EU082088.2). Ein Vergleich der Genomsequenzen von DEV 2085 und VAC mit Teil-Sequenzen des virulenten CHv Stammes und dem attenuierten Stamm Clone-03 wurde durchgeführt, um Nukleotid- oder Aminosäuren-Polymorphismen zu identifizieren, die potentiell zur Virulenz von DEV beitragen. In 24 der 78 ORFs wurden keine Aminosäure-Veränderungen identifiziert. Ein Ergebnis, das auf hohe Konservierung in DEV schließen lässt und das unabhängig vom Ursprung des Stammes oder seiner Virulenz ist. Des Weiteren wurden in 39 ORFs nicht- synonyme Nukleotid-Substitutionen entdeckt. Die verbleibenden 15 ORFs hatten Fragment-Insertionen bzw. –Deletionen, Verschiebungen des Leserahmens- oder nichtsynonyme Nukleotid-Substitutionen mit einem Effekt auf die Translations- Initiation oder Terminierung des jeweiligen Leserahmens. In 7 der 15 ORFs mit hoher, und 27 der 39 ORFs mit niedriger Variabilität wurden Polymorphismen ausschließlich in DEV 2085 gefunden, ein Befund, der wahrscheinlich im unterschiedlichen Ursprung dieses Stammes (Europa) gegenüber den drei ost- asiatischen Stämmen begründet ist. Fünf ORFs (UL2, UL12, US10, UL47 und UL41) mit Polymorphismen waren identisch zwischen dem virulenten DEV 2085 und CHv, unterschieden sich jedoch von den attenuierten Stämmen VAC oder Clone-03 und könnten potentielle DEV Virulenzfaktoren sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass (1) das Fehlen von DEV gC zur Zunahme der Plaquegrößen in vitro führt, (2) gC eine Rolle in der Freisetzung des DEV spielt und (3) die Konstruktion eines infektiösen DEV Klons eine schnelle Generierung von Vektor- basierenden Impfstoffen zulässt. Dazu ergab (4) der Verglich des europäischen DEV-Stammes 2085 mit den ost-asiatischen DEV-Stämmen VAC, Clone-03 und CHv, dass die ORFs UL2, UL12, US10, UL47 sowie UL41 potentielle DEV- Virulenzfaktoren darstellen werden.