Untersuchung der Interaktion von Matrix-Metalloproteinasen mit nicht-Substrat Kollagenen und Kollagenmimetika mittels Surface-Plasmon-Resonance. Lokale Modulation von Bindung und Aktivität der Matrix-Metalloproteinasen als Basis neuer therapeutischer Ansätze

Abstract

Die Leberfibrose ist durch vermehrte Akkumulation von extrazellulärer Matrix (EZM) charakterisiert. Antifibrotische Therapieansätze zielen sowohl auf die Verringerung der EZM-Synthese als auch den verstärkten EZM-Abbau, z.B. durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Kollagene als Hauptbestandteile der EZM modulieren indirekt durch die Speicherung von MMPs und Wachstumsfaktoren (WF) zelluläre Prozesse wie Proliferation, Migration und Differenzierung. Die gezielte Beeinflussung dieser Matrix-Bindung von MMPs oder WF stellt einen rationalen Ansatzpunkt für neue lokal wirkende, therapeutische Strategien dar. Voraussetzung dafür ist die Kenntnis des Bindungsverhaltens der biologisch wirksamen Moleküle an Kollagene aus der EZM. Ziel dieser Arbeit war daher die Bestimmung der Bindungsstärken der Gelatinasen und Kollagenasen an Kollagene bzw. Kollagenfragmente sowie die mögliche Modulation dieser Bindungen. Bindungsstudien wurden unter Einsatz der Surface Plasmon Resonance-Methode durchgeführt. MMP-Kollagen-Wechselwirkungen wurden zusätzlich in situ auf Gewebeschnitten der Leber, in enzymatischen Aktivitätsassays sowie in vitro mit hepatischen Sternzellen untersucht. Die Dissoziationskonstanten (KD-Werte) der Bindungen der Gelatinasen proMMP-2 und -9 an tripelhelikales Kollagen I (KI) lagen im Bereich von KD ~ 10-7 M. Die Bindung der aktivierten MMPs war um den Faktor 4 schwächer. Die proMMP-2-Bindung an das synthetische, tripelhelikale Kollagenmimetikum (GPO)10 war ca. 100fach stärker als die proMMP-2-Bindung an KI. (GPO)10 schwächte die proMMP-2-Kollagenbindung kompetitiv, was zu Freisetzung zuvor Kollagen-gebundener MMPs führte. (GPO)10 wirkte zusätzlich als Aktivator von proMMP-2. Die u.a. durch MMP-2 stimulierbare Proliferation hepatischer Sternzellen wurde durch (GPO)10 gesteigert. Die Kollagenasen proMMP-1, -3, -8 und proMMP-13 banden mit KD- Werten im Bereich von KD ~ 10-8 M an das nicht-Kollagenasesubstrat Kollagen VI (KVI). Die isolierten KVI-Einzelketten waren darüber hinaus als Kollagenase- Inhibitoren wirksam. Aus den Ergebnissen ergeben sich folgende Schlussfolgerungen: nicht-Substrat Kollagene wie die in der Leberfibrose verstärkt hochregulierten Kollagene I und VI wirken als Speicher für inaktive proMMPs der Gelatinasen bzw. Kollagenasen. Das synthetische Kollagenmimetikum (GPO)10 kann kompetitiv Kollagen-gebundene Proformen der Gelatinasen freisetzen und führt zu damit einhergehender proMMP-2 aktivierung. KVI-Ketten wirken als Kollagenase Inhibitoren. Die gezeigte Kollagenspeicherung von z.B. proMMP-2 impliziert einen Therapieansatz auf Basis lokaler proMMP-2-Freisetzung aus der Lebermatrix und gleichzeitiger proMMP-2-Aktivierung. Dies könnte einen Abbau fibrotischer Kollagenmatrix induzieren und damit die Fibroseresolution fördern. Der Einsatz der als Kollagenase-Inhibitoren wirksamen KVI-Ketten bzw. von strukturähnlichen, synthetischen Kollagenmimetika ist bei MMP-assoziierten, pathologischen Prozessen wie Tumormetastasierung denkbar.

Liver fibrosis is characterized by accumulated extracellular matrix (ECM). Anti-fibrotic therapy therefore aimed at decreasing matrix synthesis and increasing ECM-degradation by matrix-metalloproteinases (MMPs). Since collagens which are the main ECM-components serve as storage site for MMPs and growth factors they therefore indirectly modulate cellular proliferation, migration and differentiation. A targeted modulation of this MMP/collagen interaction offers a rational approach for a local fibrolytic therapy. Evaluation of binding structures and domains together with binding strength and kinetics is pivotal. Aim of this work was to elucidate the binding strength of gelatinases and collagenases to non-substrate collagens, collagen derived fragments and collagen analogs. Kinetic parameters were obtained using the surface-plasmon-resonance method (Biacore). MMP/collagen interactions were then studied in situ using human cirrhotic liver slides and in enzymatic activity assays. Finally cellular effects using hepatic stellate cells were investigated. The dissociation-constants (Kd-values) of the gelatinases proMMP-2 and -9 bound to triple helical collagen type I (CI) were in the range of Kd ~ 10-7 M. Activated enzymes showed a 4fold weaker binding to CI. The binding strength of proMMP-2 to the synthetic triple helical collagen analog (GPO)10 was about 100fold stronger than binding to CI. (GPO)10 was shown to be a potent competitor of the proMMP-2-CI binding. The observed (GPO)10-induced activation of proMMP-2 lead to a strongly reduced binding to CI. MMP-2 mediated proliferation of hepatic stellate cells was induced after treatment with (GPO)10 implicating endogenous proMMP-2 activation by the synthetic collagen analog. The collagenases proMMP-1,-3,-8 and proMMP-13 bound to the non-substrate collagen type VI (CVI) with a Kd ~ 10-8 M. In enzymatic activity assays the isolated single chains of CVI functioned as collagenase-inhibitors. Based on these results we conclude that non-substrate collagens CI and CVI which are highly upregulated during liver fibrosis act as storage site for inactive proMMPs. The synthetic triple helical (GPO)10 could be used to competitively release collagen-bound proMMP-2 and -9 which is accompanied by proMMP-2 activation. In contrast, CVI single chains serve as collagenase inhibitors. The use of such synthetic collagen analogs such as (GPO)10 could become the basis of a local therapeutic antifibrotic strategy by releasing and activating collagen-stored progelatinases thereby initiating degradation of fibrotic neomatrix and fibrosis resolution. Since the CVI single chains act as collagenase inhibitors peptides or structural analogs should be explored as MMP-inhibitors in MMP-associated pathological processes like tumor metastasis.