Nicht-viraler Gentransfer mittels Magnetofektion bei primären Zellen des Equinen Sarkoids: In-vitro-Studie im Hinblick auf eine adjuvante Gentherapie des Equinen Sarkoids

Abstract

Equine Sarkoide gehören zu den häufigsten Tumorerkrankungen beim Pferd und stellen mehr als 90 % der Hauttumore bei dieser Spezies dar. Obwohl die Neoplasie nicht metastasiert und nicht direkt lebensbedrohlich ist, entstehen den Besitzern betroffener Pferde häufig hohe Kosten. Diese sind in der hohen Rezidivneigung Equiner Sarkoide und der Notwendigkeit wiederholter und langwieriger Behandlungen begründet. Darüber hinaus führt das gehäufte Auftreten in Sattel- oder Gurtlage und am Kopf zu einer Nutzungseinschränkung und somit zu einem Wertverlust der Tiere. Als Ursache der Erkrankung wird eine Infektion der Pferde mit den bovinen Papillomaviren-1 und -2 in Verbindung mit einer genetischen Prädisposition angesehen. Diese Infektion führt zu einer Verminderung oder gar Verlust von MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche infizierter Hautzellen, so dass das Immunsystem entartete Zellen nicht erkennen und bekämpfen kann. Es besteht eine Vielzahl an verfügbaren Therapieformen, die von der konventionellen Chirurgie über die Herstellung autologer Vakzine bis zu diversen Ansätzen der Immuntherapie reichen. Viele dieser Behandlungen setzten invasive Eingriffe voraus und die Rezidivneigung ist hoch. Ziel einer gentherapeutischen Behandlung Equiner Sarkoide ist die Anregung des körpereigenen Immunsystems zur Heilung der Tumore und damit eine verminderte Rezidivbildung. Gentherapeutische Ansätze zur Behandlung von Krebs und anderen Erkrankungen sind in der Humanmedizin weitverbreitet und werden auch im Kleintierbereich zur Behandlung bereits mit guten Erfolgen eingesetzt. Ziel dieser Arbeit war es, eine effektive und sichere Methode des Gentransfers für primäre Zellkulturen des Equinen Sarkoids zu finden, die sich auch für einen zukünftigen Einsatz in vivo eignet. Deshalb wurden Methoden des nicht- viralen Gentransfers beurteilt. Zur Gewinnung der primären Zellkulturen wurde Tumorgewebe von zwölf Tieren, die zur Entfernung Equiner Sarkoide in der Pferdeklinik der tierärztlichen Fakultät der Ludwig Maximilians-Universität in München behandelt wurden, verwendet. Um eine effektive Methode des nicht- viralen Gentransfers für primäre Zellen des Equinen Sarkoids zu finden, wurden Zelllinien von sechs Tieren jeweils mit der Methode der Magnetofektion und dem Standard-Transfektionsvorgehen „Lipofektion“ transfiziert und die Ergebnisse miteinander verglichen. Dabei zeigten sich Unterschiede bei Verwendung verschiedener Transfektionsreagenzien und Kulturmedien. Bei allen durchgeführten Teilversuchen zeigte sich eine höhere Transfektionseffizienz, gemessen an Nanogramm Luciferase pro Milligramm produziertem Zellprotein, bei Einsatz der Magnetofektion. In den unteren eingesetzten Dosisstufen konnten durch die Einwirkung des Magnetfeldes hochsignifikante Steigerungen erreicht werden. Diese Ergebnisse stimmen mit denen vorangegangener Studien im Bereich der Kleintier- und Humanmedizin überein. Damit ist die Methode Magnetofektion für einen späteren Einsatz zum nicht-viralen Gentransfer bei Equinen Sarkoiden in vivo geeignet. Im zweiten Versuchsteil wurden Zellkulturen des Equinen Sarkoids mit Plasmiden, die für feline Zytokin-Gene kodieren, transfiziert. Dies erfolgte auch mit der Methode der Magnetofektion. Dazu wurden primäre Zellen aus Equinen Sarkoiden von sechs Tieren, bei denen das Onkoprotein E5 der Bovinen Papillomaviren-1 und-2 nachgewiesen wurde, verwendet. Ziel dieses Experiments war es, den Einfluss feliner Zytokine auf die Ausprägung der MHC-I-Moleküle auf der Oberfläche der Zellen zu evaluieren. Die erreichten Steigerungen bei der MHC-I-Ausprägung wurden allerdings auch bei Transfektion mit dem Kontrollplasmid pBluc erreichen. Dabei ließen sich sowohl bei der Transfektion mit den felinen Plasmidgenen IFN-γ und GM-CSF leichte Steigerungen der MHC-I-Moleküle erreichen. Diese vermehrte Ausprägung kultivierter Zellen des Equinen Sarkoids kann auf eine unspezifische Immunstimulation aufgrund des DNA-Gerüsts der eingesetzten Plasmide zurückgeführt werden. Weiterführende Untersuchungen sollten deshalb zunächst mit den entsprechenden equinen Plasmidgenen durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte ein Proliferationsassay durchgeführt werden, um die biologische Aktivität der Zytokine nachzuweisen.

Equine Sarcoids are the most common tumors in horses and represent more than 90% of skin tumors in this species. Although it is a non-matastasising neoplasia and not directly life-threatening, the owners of affected horses are often confronted with high costs. These are due to the high recurrence rate of Equine Sarcoids and the need for repeated and extensive treatments. In addition the frequent occurrence on sites like saddle and girth region and head lead to a restricted use and thus to a loss of value of the animals. An infection of horses with the Bovine Papillomavirus 1 and -2 in combination with a genetic predisposition of certain individuals, is considered as the cause of the disease. This infection leads to a reduction or even loss of MHC I molecules on the cell surface of infected skin cells, so that the immune system can not detect and fight malignant cells. There is a variety of available therapies, ranging from conventional surgery on the production of autologous vaccines to various approaches of immunotherapy. Many of these treatments require invasive procedures and the continued tendency to relapse is high. The aim of gene therapy in treating Equine Sarcoids is to stimulate the body's immune system to cure tumors and thus reduce the incidence of relapse. Gene therapy methods for the treatment of cancer and other diseases are widely used in human medicine and there are already promising results in small animal medicine. The aim of this work was to find an effective method of non-viral gene transfer for primary cell cultures of Equine Sarcoids, which should also be suitable for a future use in vivo. To obtain the primary cell cultures, tumor tissue from twelve animals was harvested. These horses were treated for removal of Equine Sarcoids in the Equine Clinic of the Veterinary Faculty of Ludwig-Maximilians University in Munich. To find an effective method of non-viral gene transfer, primary cell lines of six horses were transfected using each the standard method “lipofection” and the relatively new method “magnetofection”. Here, differences were found when using different transfection reagents and culture media. In all experiments carried out, cells transfected using the magnetofection protocol showed higher transfection efficiency, measured in nanogram luciferase per milligram of cell protein produced. In the lower dose levels used, highly significant increases could be achieved by the action of the magnetic field. These results are consistent with those of previous studies in the field of small animal and human medicine. Thus, the method is suitable for later use for non-viral gene transfer in Equine Sarcoids in vivo. In the second trial, the effect of heterologous feline cytokines on the presentation of MHC-I molecules on the surface of cultured tumor cells of the Equine Sarcoid was investigated. These cells were primary cells from Equine Sarcoids of six animals in which the oncoprotein E5 of Bovine Papillomavirus-1 and -2 was detected. Transfection using the magnetofection method with both the feline plasmid genes IFN-γ and GM-CSF achieved a slight increase of MHC I molecules. This increased expression of MHC-I molecules, however, was also obtained when cells were transfected with the control plasmid pBluc. The effect of the introduced plasmids on the surface properties of cultured cells of the Equine Sarcoid might therefore be the effect of nonspecific immune stimulation. This is due to the DNA backbone of the plasmids used.