Der Einfluss der intraperitonealen und intravenösen Applikation von Emodin und BTB14431 in der konventionellen Chirurgie auf das intra- und extraperitoneale Tumorwachstum bei Ratten

Abstract

Mit dem Ziel, die deregulierte Wachstumskontrolle und die Überlebensstrategien malignerTumoren zu beeinflussen, stellt die Entwicklung effektiver und nebenwirkungsarmer antineoplastischer Substanzen zur Therapie maligner Tumoren einen bedeutenden Bestandteil der Forschung dar. Eine Verstärkung des tumorinhibierenden Effektes sowie die Reduktion unerwünschter Wirkungen bieten neue Perspektiven in der lokalen und systemischen Chemotherapie maligner abdominaler Tumoren. Zahlreiche in vitro Studien konnten nachweisen, dass Emodin, der Inhaltsstoff einiger traditioneller chinesischer Heilpflanzen, eine wichtige Rolle bei der Inhibition von Tumorprogression, -invasion und -metastasierung spielt. In vivo Untersuchungen belegten, dass nach oraler oder intraperitonealer Therapie mit Emodin Tumorwachstum reduziert werden konnte. Zahlreiche experimentelle Studien konnten nachweisen, dass Emodin durch Apoptose und andere intrazelluläre Wirkmechanismen Tumorwachstum signifikant reduzieren kann. Als Grundlage für das hier vorgestellte Tierexperiment diente ein Projekt, bei dem anhand der Leitstruktur Emodin ein in silico Screening durchgeführt wurde, um strukturähnliche und analoge Substanzen zu finden. Dabei wurde die Substanz BTB14431 als ein weiterer möglicher Inhibitor der an das COP9-Signalosom (CSN-) assoziierten Kinasen CK2 und PKD identifiziert. Die Zugabe dieser beiden Substanzen zu den rekombinanten Kinasen oder dem aufgereinigten CSN führte zu einer Hemmung der Kinaseaktivität von PKD, CK2 und des aufgereinigten CSN-Komplexes. Nach der Zugabe von Emodin und BTB14431 zu Tumorzellen (humane Zervixkarzinomzellen-HeLa, B8 Mausfibroblasten) konnte ein vermindertes Tumorwachstum durch eine Stabilisierung des Tumorsuppressors p53 und eine Destabilisierung von c-Jun gegenüber einer Ubiquitin- und Proteasom-abgängigen Proteolyse beobachtet werden. In dieser Arbeit wurde vor dem Hintergrund einer besseren Therapiemöglichkeit des humanen kolorektalen Karzinoms mit einem standardisierten tierexperimentellen (WAG/Rij– Ratten) Tumormodell (CC531-Zellen) im Langzeitversuch die tumorsupprimierende Wirkung von Emodin und BTB14431 unter besonderer Berücksichtigung von unerwünschten Wirkungen in Abhängigkeit von Applikationsweise und Dosierung untersucht. Die Tiere wurden in sechs intravenös und sechs intraperitoneal behandelte Therapiegruppen randomisiert. 20 Minuten nach medianer Laparotomie erfolgten eine intraperitoneale Applikation von Kolonadenokarzinomzellen (Suspension) auf das Coecum und danach ein zweischichtiger Wundverschluss. Anschließend erfolgte eine subkutane Injektion der Tumorzellsuspension im Nackenbereich der Tiere, welche eine Fernmetastasierung darstellte. Unmittelbar anschließend wurde entsprechend der Randomisierung mit der intravenösen bzw. der intraperitonealen Therapie begonnen, die sieben Tage lang alle 12 Stunden verabreicht wurde. Bei den intravenös zu behandelnden Tieren wurde die Therapielösung über ein Portsystem während einer kurzen Inhalationsnarkose appliziert. Unmittelbar präoperativ und am Tag nach der letzten Therapiegabe wurden peripher venöse Blutentnahmen durchgeführt. Drei Wochen nach Beendigung der Therapie wurden die Tiere euthanasiert und das Tumorwachstum beurteilt. Emodin und BTB14431 hatten in diesem Experiment keinen Einfluss auf das Wachstum von CC531-induzierten Tumoren. Das Operationstrauma ist der größte Einflussfaktor auf den Leukozytenverlauf. Dosisabhängig führen intravenöse Emodin-Applikationen bis zu einer vollständigen Mortalität unter WAG/Rij–Ratten. Unerwünschte Wirkungen wie Wundheilungsstörungen, gestörtes Allgemeinbefinden, vermindertes Wachstum der Tiere oder gar andauernder Gewichtsverlust oder Veränderungen des peripheren Blutbildes im Sinne einer eingeschränkten Knochenmarksfunktion wurden bei höheren Dosierungen nicht beobachtet. Im Gegensatz zu anderen Studien wurden in diesem Experiment keine signifikanten tumorsupprimierenden Effekte nach intraperitonealer Therapie von Emodin beobachtet. Emodin und BTB14431 bleiben jedoch interessante, neuartige Substanzen, die Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein werden.

The development of effective antineoplastic drugs with low side effects for treatment of malign tumours by influencing their deregulated growth control and survival strategies is a major part of current medical research. Increase of tumour inhibitory effects as well as the reduction of unwanted results yields new perspectives in the local and systemic chemotherapy of malign abdominal tumours. Numerous in vitro studies show that emodin, contained in several traditional Chinese medical plants, has an important place in the inhibition of tumour progression, -invasion and –metastasiation. In vivo studies demonstrated reduced tumour growth after oral or intraperitoneal application of emodin. Many experimental studies showed that emodin significantly reduces tumour growth by inducing apoptosis and other intracellular control mechanisms. An in silico screening for analogue and structural similar substances of emodin was the basis for the presented animal experiment study. In the screening the antrachinone BTB14431 was found to be a potential inhibitor of the COP9-signalosome (CSN) associated kinases CK2 and PKD. Application of both substances to the recombinant kinases or to the purified CSN resulted in a reduction of the kinase activity of PKD, CK2 and of the purified CSN complex. Treatment of tumour cell lines (human cervix carcinoma cells - HeLa, B8 murine fibroblasts) with emodin and BTB14431 yielded a reduced cell growth and a stabilisation of the tumour suppressor p53 and destabilisation of c-Jun in regard to ubiquitine - proteasome – dependent proteolysis. This study examines the tumour suppressing effect of emodin and BTB14431 in a standardized animal experimental (WAG/Rij rats) tumour model (CC531 cells) with special consideration of unwanted side effects in regard to the route of application and dose. The goal of this long term study is a better therapy of the human colorectal cancer after surgical displacement of the tumour. The animals were randomized into 6 groups treated intraperitoneally and 6 groups treated intravenously. A suspension of colon adenocarcinoma cells were applied to the caecum of the rats 20 minutes after a laparotomy followed by a two level closing of the wound. Afterward the tumour cell suspension was applied to the neck region subcutaneously as distant metastasing directly followed by the first application of the 7 days every 12 hours therapy according to the respective therapy groups. The intravenous application was done by usage of a port system and a short inhalation narcosis. Blood probes were taken from the peripheral veins just before the operation and on the day after the 7 day therapy. Three weeks after the end of the therapy the animals were euthanized and the tumour growth evaluated. Emodin and BTB14431 showed no influence on the growth of CC531 induced tumours in this experiment. The trauma of the operation is the biggest influence on the amount of the leukocytes. Depending on the dose the intravenous application of emodin resulted in a high up to total mortality of the WAG/Rij rats. Side effects like reduced wound healing, disturbed general condition, reduced growth, persistent weight loss, and changes of the blood count could not be observed at increased doses. In contrast to other studies no significant tumour suppressing effects of emodin could be observed for the intraperitoneal therapy. However, emodin and BTB14431 remain interesting new substances that will be subject of further studies.