The Mass Spectrometry Toolkit for Glycoprotein Characterisation: Development of Novel Analytical Methods and Technologies for Glycomics and Glycoproteomics

Abstract

Glycosylation is one of the most complex yet common PTMs, which drastically enhances the functional diversity of proteins and influences their biological activity. Understanding relationships between structure, location, and function of glycoproteins requires detailed information about peptide sequence, glycan composition and sites of glycosylation. Tandem mass spectrometry (MS/MS) is a powerful tool to determine such data due to its ability to derive structural information about glycans and peptides as well as to localise sites of glycosylation. In this work several novel analytical and quantitative mass spectrometric tools have been developed for glycomics and glycoproteomics research. Glycan identification and characterisation is crucial to correlate glycan structure to biological function. An in-depth glycan sequencing tool was developed that is based on Porous Graphitized Carbon Liquid Chromatography (PGC-LC) ElectroSpray Ionisation (ESI) tandem Mass Spectrometry (MS/MS). The diagnostic fragment ions observed in negative mode fragmentation in combination with the high separation capacity provided by the PGC was the basis to develop a reliable, fully customisable Glyco Relative retention time (RRT) MS/MS library that enables now high-throughput automated glycan identification and characterisation from PGC-LC ESIMS/MS data. Though this system works well for human glycans, glycomics from less well characterised species also requires knowledge on the monosaccharide building blocks. Many of these are indistinguishable by mass alone, and also detailed linkage information is not always obtained by MS/MS analyses. This obstacle was overcome by developing a novel, simple and sensitive method for unambiguous identification and linkage determination of various monosaccharides (including N-acetylneuraminic acids) using Reverse Phase (RP) – LC -ESI-MS/MS based approach that now can provide this information from minimal amounts of starting material. Well-defined synthetic peptides and glycopeptides represent unique analytical glycoproteomics tools. Amino acid building blocks modified with large N-linked glycans for solid phase peptide synthesis (SPPS), however, are not commercially available. In the present work a fast and "environmentally friendly" method was developed for the fast and efficient isolation of a glycosylated asparagine building block carrying complex sialylated biantennary N-glycans from egg yolk. The obtained glyco amino acid building blocks were applied in solid phase glycopeptide synthesis after converting them into Fmoc protected glyco-amino acids and selective protection of the sialic acids. These building blocks were used to generate a synthetic glycopeptide library that fostered the systematic investigation and optimisation of various glycoproteomic sample preparation steps and analysis parameters. A novel, simplified technique for HILIC (hydrophilic interaction chromatography) based glycopeptide enrichment termed "Drop-HILIC" was developed and applied to systematically evaluate the mobile phase effect on ZIC-HILIC (zwitterionic type HILIC) glycopeptide enrichment. Acetonitrile, Methanol Ethanol and Isopropanol were tested, and Acetonitrile was found to provide the best compromise for the retention of both hydrophilic and hydrophobic glycopeptides. Though isopropanol enriched more glycopeptides, is also co-enriched more non-glycosylated peptides. Methanol was confirmed to be unsuitable for the purpose of ZIC-HILIC based glycopeptide enrichment. This synthetic glycopeptide library also served as a basis for the systematic investigation of glycopeptide fragmentation and their ionisation behaviour in LC-MS-CID/ETD, which in turn allowed optimising analysis conditions for biologically relevant samples in glyco-biomarker research. An investigation on ETD fragmentation efficiency was performed on a panel of isobaric glycopeptides differing only in the position of glycosylation site, revealing that ETD fragmentation efficiencies depended on glycan size and glycosylation site location. Severe limitations reported earlier for glycopeptide ionisation were overcome by the CaptiveSpray Nanobooster™ ionisation technique, which was systematically investigated using a commercially available Mass Spectrometry Retention Time calibration mix and selected synthetic glycopeptides. CaptiveSpray Nanobooster™ ionisation of glycopeptides depended on the physio- chemical properties of the dopant solvent, and acetonitrile provided the best results as it enhanced glycopeptide signal intensities and increased their charge state at the same time. The in this thesis presented novel analytical and quantitative mass spectrometric tools provide a solid, sensitive and automatable basis that is now being applied to gain a better understanding of the biological role of protein glycosylation.

Die Protein-Glykosylierung ist eine der komplexe und weit verbreitete, post- translationelle Modifikation, die auch einen wesentlichen Einfluss auf die Struktur und Aktivität von Proteinen hat. Um das Verhältnis zwischen Struktur, Position und Funktion der Glykoproteine zu verstehen sind detaillierte Daten zur Peptidsequenz, der Glykanstruktur und deren Position innerhalb des Glykoproteins essentiell. Die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) stellt eine hierfür weit verbreite Methode dar um diese Daten zu akquirieren. Sie bietet die Möglichkeit, diese Strukturinformationen über Glykane und Peptide zu gewinnen. Darüber hinaus kann in bestimmten Fällen auch die Position der Glykane innerhalb eines Peptides bestimmt werden. Daher war es ein wesentliches Ziel dieser Arbeit neue analytische Methoden und quantitative massenspektrometrische Werkzeuge für die Glykomik und Glykoproteomik zu entwickeln. Die Identifizierung von Glykanen und deren Charakterisierung ist essentiell um deren funktionelle Relevanz zu eruieren. Eine hochsensitive und selektive Glykomik-Methode wurde auf Basis der "Porous Graphitized Carbon" (PGC) Flüssigkeitschromatographie (LC), welche mit einer ElektroSpray Ionisation (ESI) MS/MS Detektion gekoppelt ist, entwickelt. Die Kombination aus der PGC-LC mit der Fragmentierung von negativ geladenen Produkt-Ionen ermöglicht das diagnostische Fragmentierungsmuster erhalten werden, welche wiederum eine exakte Identifizierung von Glykanstrukturen ermöglicht. Dies war die Basis für die Entwicklung einer umfassenden MS/MS Spektren-Bibliothek. Darüber hinaus wurde für all diese Glykanstrukturen auch eine "Relative Retention Time" (RRT) Bibliothek entwickelt, welche zusammen mit der MS/MS Spektren- Bibliothek eine noch genauere Strukturbestimmung der Glykane ermöglichte und gleichzeitig auch einen wesentlichen Schritt vorwärts zur Automatisierung der PGC-LC ESI MS/MS basierten Glykomik darstellte. Obwohl dieses System eine detaillierte Sequenzierung des humanen N- und O-glykoms ermöglichte, benötigt die Glykomanalytik aber auch das Wissen über die Identität der einzelnen Monosaccharide, aus welchen Glykane aufgebaut sind. Dies ist insbesondere wichtig wenn Glykoproteine nicht humanen Ursprungs charakterisiert werden sollen, da viele dieser Zuckermoleküle nicht einfach durch rein massenspektrometrische Methoden eindeutig identifiziert werden können. Darüber hinaus ist es auch wichtig die Verbindungen zwischen den jeweiligen Monosacchariden zu kennen. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit auch neue, einfache und sensitive LC-MS basierte Methode für die eindeutige Identifizierung von Monosacchariden inklusive Sialinsäuren und deren Verknüpfungen entwickelt, welche es ermöglicht diese Informationen auch aus geringsten Probemengen zu bestimmen. Definierte, synthetische Peptide und Glykopeptide sind einzigartige, analytische Werkzeuge für die Glykoproteomik. Aminosäure Bausteine, welche in der Festphasenpeptidsynthese verwendet werden können und auch komplexe, hochmolekulare N-Glykane tragen, sind aber nicht kommerziell verfügbar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine schnelle und umweltfreundliche Methode entwickelt die eine einfache Isolierung von glykosylierten Asparagin-Bausteinen aus Hühnereigelb möglich machte. Die gewonnenen Aminosäurebausteine wurden nach entsprechender Modifizierung durch Fmoc und gezielter Einführung von Schutzgruppen für die Sialinsäuren in weiterer Folge in die Glykopeptid-Festphasensynthese eingesetzt und eine Bibliothek definierter synthetischer Glykopeptide wurde erstellt. Diese Glykopeptid-Bibliothek wurde in weiterer Folge zur systematischen Evaluierung und Optimierung von unterschiedlichen, essentiellen Probenvorbereitungs- und Analysemethoden verwendet. Eine neue, vereinfachte Methode, "Drop HIILIC", wurde für die HILIC ("hydrophilic interaction chromatography") basierte Anreicherung von Glykopeptiden entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es nun möglich den Effekt der mobilen Phase auf die Glykopeptid-Anreicherung systematisch zu evaluieren. Acetonitril, Methanol, Ethanol und Isopropanol wurden hierfür getestet. Bei diesen Analysen zeigte sich, dass Acetonitril den besten Kompromiss aus selektiver Anreicherung und geringer Co-Anreicherung von nicht-Glykopeptiden lieferte. Obwohl durch die Verwendung von Isopropanol eine größere Anzahl von Glycopeptiden aus humanen Serum angereichert werden konnte, war auch der Anteil an unspezifisch angereicherten, nicht glykosylierten Peptiden wesentlich höher verglichen mit Acetonitril. Methanol hingegen war nicht geeignet für den ZIC-HILIC basierte Glykopeptidanreicherung. Mit Hilfe der synthetischen Glykopeptid-Bibliothek konnte auch eine systematische Evaluierung des Glykopeptid-Ionisationsverhaltens und der ETD relevanten Fragmentierungseigenschaften untersucht werden. Dies erlaubte in weiterer Folge eine Verbesserung und Optimierung der Glykopeptidanalytik für biologisch relevante Fragestellungen im Bereich der Glyko-Biomarker Forschung. Durch diese Arbeiten zeigte sich, dass die ETD Fragmentierungs-Effizienz stark von der Glykangröße und der Position innerhalb eines Glykopeptides zusammenhängt. Die "CaptiveSpray Nanobooster™" Ionisierungstechnik erlaubte es die schwachen Ionisierungseigenschaften von Glykopeptiden signifikant zu verbessern, was auch mittels eines kommerziell erhältlichen Retentionszeit- Kalibierungsstandards und einer Reihe von synthetischen Glykopeptiden nachgewiesen wurde. Es zeigte ich darüber hinaus, dass die "CaptiveSpray Nanobooster™" Ionisierungstechnik stark von dem Lösungsmittelzusatz beeinflusst wird. Eine systematische Evaluierung unterschiedlicher Lösungsmittel zeigte, dass Acetonitril die besten Ergebnisse in Bezug auf die Glykopeptid-Signalstärke und die Protonierungseigenschaften von Glykopeptiden brachte. Die im Rahmen dieser Arbeit neu entwickelten, analytischen und quantitativen Methoden zur Glykoproteomik bilden nun eine solide, sensitive und automatisierbare Plattform. Diese findet nun Anwendung um die funktionelle Rolle der Protein-Glykosylierung anhand individueller Glykoproteine besser untersuchen zu können.