Mechanisms of Tyrosinase Mediated Crosslinking Reactions Enabling the Synthesis of Hydrogels with Potential for Pharmaceutical Applications

Abstract

Enzyme-catalyzed reactions are a possible alternative approach for the generation of hydrogels for biomedical applications, whereby the specificity of enzymatic reactions as well as the crosslinking in mild and cytocompatible conditions are evaluated as particularly advantageous. In this doctoral thesis, a basic understanding of the principles of enzymatically induced network synthesis should be established and tyrosinase (mTyr) was selected as a physiologically relevant enzyme. The work has been developed based on the hypothesis that DAT(T) is a suitable alternative substrate for mTyr and applying DAT(T) as a functional group of hydrophilic telechels allows the generation of hydrogels with systematically controllable properties. In the first part, the suitability of free dissolved DAT(T) as a substrate for mTyr should be tested and various (model) precursors of DAT(T) -functionalized oligoethylene glycol synthesized. In the second step, mechanistic aspects of the tyrosinase catalyzed cross-linking of linear, monofunc-tionalized model precursors should be studied in order to decipher the reaction pathways and the nature of the formed netpoints as well as the involved chemical species. In the third step, the application potential of the cross-linking reactions for the synthesis of hydrogels from star-shaped telechelics should be demonstrated. A comprehensive understanding of the complex system should be achieved by a systematic analysis of physicochemical properties, network structures and diffusion-controlled release of bioactive macromolecules. The selected substrates DAT and DATT showed a threefold (DAT) or ninefold (DATT) higher mTyr activity compared to the natural phenolic substrate L-tyrosine in kinetic studies, which confirmed the suitability of the substrates for the studies planned here. To elucidate the reaction mechanism, which consists of an enzyme catalyzed reaction of DAT(T) to reactive species with subsequent spontaneous crosslinking, by means of soluble reaction products, DAT monofunctionalized oligomers (DAT-lOEG-OMe 10 kDa and 2 kDa, respectively) were synthesized and employed in model reactions. Thereby, o-diphenol and o-quinone groups have been identified as enzymatically produced reaction intermediates for the reaction of free and oligomer-bound DAT by UV-Vis as well as NMR spectroscopy. An increase in signals characteristic of o-quinonoid structures, along with a decrease in the aromatic character of DAT end groups, was also detected by FT-IR spectroscopy of DAT-lOEG-OMe 2 kDa. By exact assignment of the m/z detected by MALDI-ToF, catechols, o-quinones, as well as for the first time monophenols, were identified as the building blocks of the oligomers formed from DAT and DAT methyl ester as a result of mTyr catalysis. In addition, the conversion of DAT ester oligomers with up to 11 repeating units could be detected by MALDI-ToF, which is an indication of the theoretically possible high network functionalities by enzyme catalysis. On the other hand, dimers and a few trimers were demonstrated from DAT-lOEG-OMe 10 kDa by mTyr catalyzed reactions, suggesting a steric hindrance by the bulky strongly hydrated OEG chains, or a lack of product ionization. MALDI-ToF and developed HPLC-ESI-MS methods showed that narrowly distributed DAT-lmOEG-OMe 2 kDa alone and in mixtures with NH2-lmOEG-OMe react quantitatively within <24 h, indicating the possible involvement of primary amines in non-enzymatic polymerization of the reactive intermediates. Furthermore, hydrogels from 4-arm sOEG precursors were prepared by varying the end group (DAT or DATT), the molecular weight, Mn (5, 10 or 20 kDa) and the amount of substrate, represented by the degree of precursor functionalization (60 and 90 mol% in the case of DATT-sOEG 10 kDa), as well as the concentration of the biocatalyst mTyr. The gel time of DAT(T)-sOEG hydrogels could be significantly reduced from 2.5 h to 5 min by the use of different enzyme concentrations. While for DAT-sOEG the gelation time decreased with increasing Mn or substrate concentration in solution, no hydrogels could be formed from DATT-sOEG 5 kDa by mTyr catalysis. The enzymatic reaction kinetics followed the sequence free DAT > DAT-lOEG > DAT-sOEG, as determined by UV-Vis spectroscopy. NMR spectroscopic detection of non-oxidized aromatic DAT and DATT end groups in swollen hydrogels confirmed that no quantitative conversion of the substrate was necessary to form hydrogels. Kinetic and steric phenomena, as well as competitive physical interactions could also explain the relatively low gel contents (up to 80%), as well as the hydrogel mechanics, which were controllable only to a small extent (elastic moduli 1-2 kPa). However, swelling studies showed a systematic change in the hydrogel properties (swelling between 1200 and 650 vol%), whereby higher mTyr concentrations reduced the swelling of DAT-sOEG hydrogels. In addition, diffusion studies with FITC-dextran with systematically varied molecular weights proved a systematic change of hydrogel mesh sizes (9-11 nm), which could be estimated by a scaling model. In a final application example, i.e. release of heparin as a therapeutic macromolecule from DAT-sOEG 10 kDa hydrogels, it was clarified that the network properties enabled quantitative release, as well as control of the release kinetics. Therefore, the hydrogels investigated herein have potential to be applied as matrices for controlled drug release.

Enzym-katalysierte Umsetzungen sind ein möglicher alternativer Ansatz zur Erzeugung von Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen, wobei die Spezifität von enzymatischen Reaktionen sowie die Vernetzung in milden und zytokompatiblen Bedingungen als besonders vorteilhaft bewertet werden. In dieser Doktorarbeit sollte ein grundlegendes Verständnis für die Prinzipien der enzymatisch induzierten Netzwerksynthese etabliert werden, wobei Tyrosinase (mTyr) als physiologisch relevantes Enzym ausgewählt wurde. Die Arbeit wurde ausgehend von der Hypothese entwickelt, dass DAT(T) ein geeignetes alternatives Substrat für mTyr ist und als funktionelle Gruppe von hydrophilen Telechelen die Erzeugung von Hydrogelen mit systematisch kontrollierbaren Eigenschaften ermöglicht . Im ersten Teil der Arbeit sollte die Eignung von frei gelöstem DAT(T) als Substrat für mTyr erprobt und verschiedene (Modell-)Präkursoren aus DAT(T)-funktionalisiertem Oligoethylenglykol synthetisiert werden. Im zweiten Schritt sollten mechanistische Aspekte der Tyrosinase katalysierten Vernetzung von linearen, monofunktionalisierten Modellpräkursoren studiert werden um die Reaktionswege und Art der gebildeten Netzpunkte sowie beteiligten chemischen Spezies zu entschlüsseln. Im dritten Schritt sollte das Anwendungspotential der Vernetzungsreaktionen für die Synthese von Hydrogelen aus sternförmigen Telechele aufgezeigt werden, wobei ein umfangreiches Verständnis des komplexen Systems durch eine systematische Analyse von physikochemischen Eigenschaften, Netzwerkstrukturen und der diffusionskontrollierten Freisetzung von bioaktiven Makromolekülen erzielt werden sollte. Die ausgewählten Substrate DAT und DATT zeigten eine dreifach (DAT) bzw. neunfach (DATT) höhere mTyr Aktivität verglichen mit dem natürlichen phenolischen Substrat L-Tyrosin in kinetischen Untersuchungen, was die Eignung der Substrate für die hier geplanten Untersuchungen bestätigte. Um den Reaktionsmechanismus, der aus einer enzymkatalysierten Umsetzung von DAT(T) zu reaktiven Spezies mit nachgeschalteter spontaner Vernetzung besteht, anhand von löslichen Reaktionsprodukten detaillierter zu verstehen, wurden im Folgenden DAT monofunktionalisierte Oligomere (DAT-lOEG-OMe 10 kDa bzw. 2kDa) erzeugt und in Modellreaktionen eingesetzt. So konnten o-Diphenol und o-Chinon Gruppen als enzymatisch produzierten Reaktionsintermediate der Umsetzung von freiem und oligomergebundenem DAT gleichermaßen durch UV-Vis- und NMR-Spektroskopie identifiziert werden. Ein Anstieg von Signalen, die für o-chinonoiden Strukturen charakteristisch sind, unter Abnahme des aromatischen Charakters von DAT Endgruppen, wurde auch durch FT-IR spektroskopische Untersuchung von DAT-lOEG-OMe 2 kDa nachgewiesen. Durch genaue Zuordnung der durch MALDI-ToF detektierten m/z wurden Catechole, o-Chinone, sowie erstmalig auch Monophenole als Bausteine der Oligomere identifiziert, die aus DAT und DAT Methylester als Resultat der mTyr Katalyse entstanden sind. Darüber hinaus konnten beu Umsetzung von DAT Ester Oligomere mit bis zu 11 Wiederholungseinheiten durch MALDI-ToF nachgewiesen werden konnten, was einen Hinweis auf theoretisch mögliche hohe Netzpunktfunktionalitäten durch Enzymkatalyse darstellt. Hingegen waren bei der mTyr katalysierte Umsetzung von DAT lOEG-OMe 10 kDa Dimere und wenige Trimere nachweisbar, was auf eine sterische Hinderung durch die sperrigen stark hydratisierten OEG Ketten hindeutet, oder auf mangelnde Produktionisierung zurückgeführt werden kann. MALDI-ToF- und entwickelte HPLC- ESI-MS Methoden zeigten, dass eng verteiltes DAT-lmOEG-OMe 2 kDa alleine, sowie in Mischungen mit NH2-lmOEG-OMe quantitativ innerhalb < 24 h reagiert, wobei Hinweise auf eine mögliche Beteiligung von primären Aminen an der nichtenzymatischen Polymerisierung der reaktiven Intermediate bestehen. Ferner wurden Hydrogele aus 4-Arm sOEG Präkursoren unter Variation der Endgruppe (DAT oder DATT), des Molekulargewichts, Mn (5, 10 oder 20 kDa) und der Substratmenge, repräsentiert durch den Fuktionalisierungsgrad d.f. (60 und 90 mol% im Falle von DATT-sOEG 10 kDa) der Präkursoren, sowie der Konzentration des Biokatalysators mTyr hergestellt. Die Gelierzeit von DAT(T)-sOEG Hydrogelen konnte durch die Verwendung von verschiedenen Enzymkonzentrationen erheblich von 2,5 h auf 5 min herabgesetzt werden. Während bei DAT-sOEG die Gelierzeit mit steigendem Mn beziehungsweise Substratmenge in der Lösung sank, konnten von DATT-sOEG 5 kDa keine Hydrogele durch mTyr Katalyse geformt werden. Die enzymatische Umsetzungskinetik folgte der Reihung freies DAT > DAT-lOEG > DAT-sOEG, wie durch UV-Vis spektroskopische festgestellt wurde. NMR spektroskopische Detektion von nicht oxidierten aromatischen DAT und DATT Endgruppen in gequollenen Hydrogelen bestätigten, dass keine quantitative Umsetzung der Substarte erfolgt und zur Ausbildung von Hydrogelen erforderlich ist. Kinetische und sterische Phänomene, sowie kompetitive physikalische Wechselwirkungen könnten auch die relativ geringen Gelgehalte (bis zu 80%) sowie die in einem geringen Umfang steuerbare Mechanik der Hydrogele (Elastizitätsmodule 1-2 kPa) erklären. Gleichwohl zeigten Quellungsuntersuchungen eine systematische Veränderung der Hydrogel- Eigenschaften (Quellung zwischen 1200 und 650 vol%), wobei u.a. höhere mTyr Konzentrationen die Quellung von DAT-sOEG Hydrogelen reduzierten. Diffusionsstudien mit FITC-Dextran mit systematisch variiertem Molekulargewicht erlaubten darüber hinaus, die anvisierte Veränderung von Maschenweiten (9-11 nm) der Hydrogele unter Anwendung eines Skalierungsmodells nachzuweisen. In einem Anwendungsbeispiel zur Freisetzung von Heparin als therapeutisches Makromolekül mit Hydrogelen aus DAT-sOEG 10 kDa wurde abschließend verdeutlicht, dass sowohl eine quantitative Freisetzung als auch ein Steuerung der Freisetzungskinetik anhand Netzwerkeigenschaften erzielt werden kann. Daher haben die hier untersuchten Hydrogele ein Potential zur Anwendung als Matrices für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung.