Immunologische Kontrolle von Anaplasma phagocytophilum durch murine neutrophile Granulozyten

Abstract

Anaplasma phagocytophilum ist ein durch Zecken übertragenes obligat intrazelluläres Gramnegatives Bakterium, das sich in neutrophilen Granulozyten seines Wirtes vermehrt. Die granulozytäre Anaplasmose äußert sich bei Tieren und Menschen meist als unspezifische fieberhafte Allgemeinerkrankung. Die Fähigkeit von A. phagocytophilum, neutrophile Granulozyten als Wirtszelle zu nutzen, ist einzigartig, da gerade diese Zellen des Immunsystems mit einer Vielzahl antimikrobieller Abwehrmechanismen ausgestattet sind. Daher ist es von grundsätzlichem Interesse, die Kontrolle von A. phagocytophilum durch neutrophile Granulozyten näher zu analysieren. Für die Untersuchungen dieser Arbeit sind murine Hoxb8-Granulozyten als Zellkulturmodell genutzt worden, die durch retrovirale Transduktion mit dem Hoxb8-Onkogen generiert worden sind und die funktionelle Ähnlichkeiten zu primären Zellen aufweisen. Diese Methodik ermöglicht einen deutlich höheren Reinheitsgrad und eine unbegrenzte Ausbeute im Vergleich zu ex vivo gewonnenen murinen neutrophilen Granulozyten. Zytokine und Chemokine sind vermutlich an der Pathogenese einer A. phagocytophilum- Infektion beteiligt. Inwieweit im Rahmen dieser Infektion neutrophile Granulozyten auch als deren Produzenten agieren, war bislang unklar. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass murine Hoxb8-Granulozyten nach Stimulation mit A. phagocytophilum, „regulated on activation, normal T cell expressed and secreted“ (RANTES), „macrophage inflammatory protein-1α“ (MIP-1α) und Tumornekrosefaktor (TNF) produzieren. In-vivo-Untersuchungen am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene in Freiburg im Breisgau haben zuvor ergeben, dass die Effektormechanismen neutrophiler Granulozyten wie Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat(NADPH)-Oxidase, induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS) und Myelo-peroxidase (MPO) für die Erregerelimination in vivo nicht notwendig sind. Anhand der vorliegenden In- vitro-Studie wird nachgewiesen, dass ein Fehlen dieser Effektormechanismen keinen Einfluss auf das Wachstum von A. phagocytophilum in Hoxb8-Granulozyten hat. Dies lässt vermuten, dass der Erreger Strategien entwickelt hat, um diesen Abwehrmechanismen zu entkommen. Interferon-γ (IFN-γ) ist ein wichtiger Modulator der Funktion neutrophiler Granulozyten. Anhand der Ergebnisse dieser Studie lässt sich zeigen, dass eine direkte IFN-γ-Stimulation von murinen Hoxb8-Granulozyten zu einer deutlichen Wachstumshemmung von A. phagocytophilum führt. Trotz deutlicher Induktion der iNOS-mRNA-Expression durch die Infektion sowie die IFN-γ-Stimulation ist dieser Effekt iNOS-unabhängig. IFN-γ-defiziente Mäuse hatten in vorausgegangenen Untersuchungen eine erhöhte bakterielle Beladung in der Frühphase der Infektion gezeigt, während die finale Erregerelimination unbeeinträchtigt blieb. Die Untersuchungen dieser Arbeit haben nun ergeben, dass eine direkte IFN-γ-Wirkung auf neutrophile Granulozyten wesentlich an dem in vivo beobachteten protektiven Effekt beteiligt ist.

A. phagocytophilum is a tick-transmitted obligate intracellular Gram-negative bacterium, which replicates within its host’s neutrophil granulocytes. The human and animal granulocytic anaplasmosis often manifests as a nonspecific febrile illness. The ability of A. phagocytophilum to use particularly neutrophil granulocytes as suitable hosts is made unique by the multitude of their antimicrobial defense mechanisms. It is therefore of considerable interest to more closely investigate the immunological control of A. phagocytophilum by neutrophil granulocytes. The chosen cell culture model for the analysis was murine Hoxb8-granulocytes, generated by retroviral transduction with the Hoxb8-oncogene. These generated cells exhibit functional similarity to primary cells. This technique enables a notably higher level of purity and allowed unlimited production in comparison with ex vivo produced murine neutrophil granulocytes. Cytokines and chemokines are presumably involved in the pathogenesis of a A. phagocytophilum infection. The extent up to which the neutrophil granulocytes act as their producer during a A. phagocytophilum infection was until now unknown. This study shows that murine Hoxb8-granulocytes produce regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α) and tumor necrosis factor (TNF), after stimulation with A. phagocytophilum. In vivo studies at the Institute of Microbiology and Hygiene had already showed that the effector mechanisms of neutrophil granulocytes, such as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and myeloperoxidase (MPO), were not required for pathogen elimination in vivo. This in vitro study demonstrates that the absence of these effector mechanisms has no influence on the growth of A. phagocytophilum in Hoxb8-granulocytes. This suggests that the pathogen has developed strategies to evade these defense mechanisms. Interferon-γ (IFN-γ) is an important modulator of the neutrophil granulocyte function. The results of this study demonstrate that a direct IFN-γ-stimulation of murine Hoxb8-granulocytes leads to a direct growth inhibition of A. phagocytophilum. Despite a noticeable induction of the iNOS mRNA-expression, due to the infection and IFN-γ-stimulation, was this effect however iNOS-independent. In previous studies IFN-γ-deficient mice exhibited an increased bacterial load during the early phase of the infection, whereas the final pathogen elimination remained unimpaired. The conclusion of this study is that a direct IFN-γ-effect on neutrophil granulocytes is essentially involved in the in vivo observed protective effect.