Molecular basis of PI3-kinase γ regulation

Abstract

Phosphoinositide 3-kinase γ (PI3Kγ) is a lipid kinase that is chiefly activated downstream of G protein-coupled receptors. By producing the lipid second messenger phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PIP3) it addresses a plethora of effector proteins that contain PIP3-binding pleckstrin homology domains. By virtue of these effectors, PI3Kγ controls many cellular processes ranging from cell survival and proliferation to chemotaxis and production of reactive oxygen species. PI3Kγ consists of a catalytic p110γ and a regulatory p101 subunit. p101 binds to Gβγ complexes released from heterotrimeric G proteins and thereby co-translocates the bound catalytic p110γ subunit to the plasma membrane, where it has access to its lipid substrate. Gβγ and Ras proteins may further stimulate catalytic activity by allosteric mechanisms. Despite their crucial role in the activation of p110γ, the binding sites on p101 for p110γ and Gβγ remained largely elusive. Therefore, this thesis primarily aimed at elucidating the elements within the primary structure of p101 that are responsible for interaction with p110γ and Gβγ.

To this end, deletion mutants of p101 were constructed and analyzed with respect to their ability to bind p110γ and Gβγ. The heterodimerization domain could be ascribed to an N-terminal region (residues 25-175), whereas the Gβγ binding domain resides within the C terminus of p101 (residues 650-850). These domains were found to be highly conserved between orthologues of p101, whereas the intervening sequence stretches display a less stringent conservation.

Strikingly, data base searches performed to identify novel p110γ\- or Gβγ- binding proteins revealed a cDNA that shows significant similarity to p101 within the p110γ\- and Gβγ-binding regions. Cloning of the corresponding coding sequence from dendritic cells and subsequent characterization of the encoded protein yielded a novel regulatory subunit of PI3Kγ. According to its molecular weight and function, it was termed PI3Kγ adapter protein of 87 kDa (p87PIKAP). p87PIKAP interacts with both p110γ and Gβγ, thereby, like p101, mediating activation of p110γ downstream of GPCR stimulation. At least one of these regulatory subunits accompanies p110γ in all cell types assayed. Whereas expression of p101 dominates in B and T cells, both subunits can be found in dendritic cells, macrophages, and neutrophils. In heart and mast cells, however, p87PIKAP is expressed almost exclusively.

In the mast cell-related cell line RBL-2H3, knockdown of p87PIKAP expression by shRNA led to diminished PI3Kγ activity and degranulation. Thus, the p110γ- dependent feedback loop, which amplifies antigen-induced degranulation via autocrine stimulation of Gi-coupled GPCRs, is dependent on p87PIKAP. A negative inotropic impact of PI3Kγ on cardiac contractility has recently been shown to be mediated by stimulation of phosphodiesterase 3B within a macromolecular complex that contains p110γ as an essential component. However, p110γ is itself unable to bind PDE3B. p87PIKAP and p110γ/p87PIKAP heterodimers were found to copurify with PDE3B from co-transfected cells, indicating that p87PIKAP may be an essential component of the PDE3B regulatory complex.

Die Phosphatidylinositol-3-Kinase γ (PI3Kγ) ist eine Lipidkinase, die vor allem nach Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren aktiviert wird. Der von ihr produzierte sekundäre Botenstoff Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3) aktiviert zahlreiche Effektorproteine, die PIP3-bindende Pleckstrin-Homologie-Domänen aufweisen. Über diese Effektoren kontrolliert PI3Kγ zahlreiche zelluläre Prozesse wie das Zellüberleben, die Proliferation oder zytoskelettale Veränderungen. PI3Kγ besteht aus der katalytischen p110γ-Untereinheit und der regulatorischen p101-Untereinheit, die für die Aktivierung der PI3Kγ essentiell ist. p101 bindet Gβγ-Komplexe und transloziert so die p110γ-Untereinheit zur Plasmamembran, wo sich ihr Lipidsubstrat befindet. Dort wird p110γ ebenfalls durch Gβγ, aber auch durch Ras, zusätzlich allosterisch stimuliert. Trotz der Relevanz der von p101 vermittelten Interaktionen blieben ihre Bindestellen für p110γ und Gβγ noch weitgehend ungeklärt. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, zunächst die Elemente in der Primärstruktur der p101 zu ermitteln, die für diese Interaktionen verantwortlich sind.

Zu diesem Zweck wurden p101-Deletionsmutanten erstellt und auf ihre Bindung zu p110γ und Gβγ hin untersucht. Die p110γ-bindende Heterodimerisierungsdomäne konnte dabei auf die Aminosäuren 25 175 eingegrenzt werden, während die Gβγ- Bindedomäne im C-Terminus der p101 liegt (Aminosäuren 650 850). Diese Domänen sind bei Orthologen der p101 hoch konserviert, während die übrigen Bereiche weniger streng konserviert sind.

In Datenbank-Suchen nach potenziellen neuen p110γ-Interaktionspartnern und unbekannten Gβγ-Effektoren wurde erstaunlicherweise eine cDNA-Sequenz identifiziert, die innerhalb der Interaktionsdomänen deutliche Ähnlichkeit zu p101 aufwies. Die Klonierung der kodierenden Sequenz aus dendritischen Zellen und die nachfolgende Charakterisierung des kodierten Proteins bestätigten, dass es sich um eine neue regulatorische PI3Kγ-Untereinheit handelt. Sie wurde als 87 kDa PI3Kγ-Adapterprotein bezeichnet (p87PIKAP). p87PIKAP interagiert mit p110γ und Gβγ und ist so in der Lage, wie p101 die Aktivierung der p110γ zu vermitteln. Mindestens einer dieser beiden Adaptoren ist in allen untersuchten p110γ-exprimierenden Zelltypen zu finden. Während in B- und T-Zellen p101 überwiegt, finden sich beide Untereinheiten in dendritischen Zellen, Makrophagen und Neutrophilen. Im Herzen und in Mastzellen hingegen ist fast ausschließlich p87PIKAP vorhanden.

In der Mastzell-verwandten Zelllinie RBL-2H3 führte eine shRNA-vermittelte Reduktion der p87PIKAP-Expression zu einer stark verminderten PI3Kγ-Aktivität und einer deutlich reduzierten Degranulation. Die p110γ-vermittelte Verstärkung der Degranulation, die über autokrine Stimulation von Gi- gekoppelten Rezeptoren verläuft, ist also von p87PIKAP abhängig. Eine negativ inotrope Wirkung der PI3Kγ im Herzen konnte kürzlich einer Stimulation der Phosphodiesterase 3B durch p110γ zugewiesen werden, die auf der Bildung eines Proteinkomplexes beruht. Jedoch kann p110γ alleine diese Interaktion nicht ausbilden. Hingegen konnte p87PIKAP alleine und in Komplex mit p110γ mit PDE3B kopräzipitiert werden. Daher könnte p87PIKAP ebenfalls ein essentieller Bestandteil des PDE3B-regulierenden Komplexes sein.