Vergleichende Untersuchung von VEGF und seinen Rezeptoren an embryonalen Gefäßendothelzellkulturen der Ratte

Abstract

Zur medikamentösen Behandlung des persistierenden DA Frühgeborener stehen seit einigen Jahren Ibuprofen und Indometacin, zwei nicht-selektive Cyclooxygenasehemmer, zur Verfügung. Dabei unterschieden sich diese beiden bisher hauptsächlich aufgrund des beobachteten Nebenwirkungsspektrums. Außer den bekannten Prostaglandinen wird der Verschluss des DA nach der Geburt durch lokal produzierte und zirkulierende Mediatoren beeinflusst. Unter ihnen spielt der Wachstumsfaktor VEGF eine essentielle Rolle, indem er einerseits durch Proliferation und Permeabilitätsänderung der Endothelien die neointimale Hyperplasie bewirkt und andererseits die Einsprossung der Vasa vasorum während der zweiten Phase des anatomischen Remodeling reguliert. Vorausgegangene Studien zeigten an der Rattenretina eine unterschiedliche Beeinflussung von VEGF und seinen Rezeptoren durch die COX-Inhibitoren. Der genaue Mechanismus ihrer Wirkung auf den DA und die Auswirkung der medikamentösen Therapie auf den Ablauf des Ductusverschlusses sind bis jetzt nicht abschließend geklärt. Anhand eines neuen, aus der Präparation von embryonalen Ratten gewonnenen, vergleichenden Endothelzellkulturmodells wurde der Einfluss von hoch und niedrig dosiertem Ibuprofen, Indometacin, Inflammation und verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen während unterschiedlicher Inkubationszeiten bis zu 24 Stunden auf das VEGF/VEGF- Rezeptorsystem erforscht. Mittels der Real-Time- PCR und ELISA wurden die Veränderungen von VEGF, VEGF-R1 and -R2 mRNA- und Proteinexpression in den Zellkulturen gemessen. Die Zellvitalität wurde anhand eines MTT-Assay determiniert, die Toxizität mit LDH- Messungen im Medium überwacht. VEGF und seine Rezeptoren wurden im Ductusendothel embryonaler Ratten nachgewiesen. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass VEGF und seine Rezeptoren 1 und 2 in Ductusendothelzellen ganz eigenen, von Endothelien permanenter Gefäße deutlich abweichenden Regulationsmechanismen unterliegen. Während Ibuprofen die mRNA-Expression von VEGF und seinen Rezeptoren erhöht, scheint Indometacin einen geringeren Einfluss auf deren Expression zu haben. In der Ductusendothelzellkultur zeigte die VEGF mRNA Expression ein Maximum nach 12 Stunden Inkubation mit hoch dosiertem Ibuprofen, während in der Aortenendothelzellkultur eine maximale VEGF R2 mRNA Expression nach 12 Stunden Inkubation mit PMA alleine oder in Kombination mit Ibuprofen nachzuweisen war. Unter Hypoxie war keine vermehrte VEGF und VEGF Rezeptor mRNA Expression im Vergleich zur Normoxie zu verzeichnen. Die unterschiedliche Wirkung der beiden COX-Inhibitoren auf VEGF und seine Rezeptoren erhellen teilweise die Interaktion zwischen Prostaglandin- und VEGF-Angiogenese-System im Ductusendothel, jedoch werden mehr neue Fragen aufgeworfen als beantwortet. Zur Einordnung der Bedeutung dieser neuen Ergebnisses sind Untersuchungen der COX- und HIF-Expression sowie des Effektes einer selektiven COX-1/2-Hemmung notwendig. Des Weiteren kann überprüft werden, ob die nachgewiesenen Effekte an den EC auch auf die Fibroblasten und VSMC des DA übertragbar sind. Das in der vorliegenden Arbeit neu etablierte Zellkulturmodell stellt die einzigartige Möglichkeit dar, Einflussfaktoren systematisch getrennt an den verschiedenen Zelltypen des embryonalen DA zu studieren. Prozesse können zerlegt, verstanden und wieder zu einem in sich stimmigen System zusammengesetzt werden.

During the last years two non-selective cyclooxygenase inhibitors ibuprofen and indomethacin have been used for pharmacological closure of the patent ductus arteriosus in preterm infants with comparable efficacy. Besides prostaglandins other locally produced and circulating mediators contribute to the closure of the ductus arteriosus after birth. Among these VEGF seems to play an essential role during anatomic remodelling by influencing formation of the neointima and vasa vasorum ingrowth until obliteration of the vessel. In retinal cells both COX inhibitors have been shown to affect the expression of VEGF and its receptors differently. Whether COX inhibition during pharmacological PDA intervention also influences the expression of VEGF and its receptors in endothelial cells of the ductus has not been investigated. Using a newly established primary cell culture model of embryonic endothelial rat cells derived from the ductus and the aorta we compared the influence of low- and high-doses of ibuprofen and indomethacin, inflammation and different oxygen concentrations during various incubation times up to 24 hours on the VEGF-VEGF-receptor system. VEGF, VEGF-R1 and R2 mRNA expression were assayed by Taqman PCR. Cell proliferation was determined by MTT assay and cell toxicity was measured by cellular LDH output into the media. VEGF and VEGF receptor mRNA expressions were detected in the embryonic rat endothelial cell cultures of both vessels. A different influence of both COX-inhibitors on the expression of VEGF and its receptors was found in aortic and ductual cells. While ibuprofen showed a positive effect on VEGF, VEGF R1 and VEGF R2 mRNA expression in both endothelial cell cultures indomethacin seems to have little influence on their expression. In the ductual cells VEGF mRNA expression showed a maximum increase after 12 hours incubation with high dose ibuprofen, whereas in the aortic cells VEGF R2 mRNA expression peaked after 12 hours incubation with either phorbol-myristate acetate alone or in combination with ibuprofen. A reduction of the oxygen concentration to hypoxic levels did not increase VEGF and VEGF receptor mRNA expressions above normoxic values. Partly the different effects of the Cox- inhibitors on VEGF and its receptors enlighten the interaction of prostaglandins and the VEGF system in the ductual endothelial cells. But these findings also raise more questions. In order to answer them more investigations are planned on HIF- and COX1/2-expression and selective COX1/2-inhibition. Moreover the different COX-inhibitor influence should also be investigated in ductual fibroblasts and smooth muscle cell cultures. The newly established cell culture model derived from embryonic rats is a unique possibility to test the multiple influencing factors on different cell subtypes of the embryonic ductus arteriosus and to gain more knowledge about the complex process of ductual closure.