Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die Expression von humanem β2-Defensin in Darmepithelien - Untersuchungen im Modell mit der epithelialen Zelllinie HT-29

Abstract

Einleitung: Bei Morbus Crohn sind eine gestörte intestinale Mukosabarriere, eine zelluläre, zytokinvermittelte Immunantwort gegen die kommensale Flora und eine gestörte Defensin-Homöostase bekannt. Das transkriptionell regulierte humane β2-Defensin (HBD-2) wird von Epithelzellen gebildet und durch bisher nicht ausreichend bekannte Mechanismen induziert. In einem Modell mit der Adenokarzinom-Zelllinie HT-29 wird der Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die HBD-2-Expression auf Transkriptions- und Translationsebene analysiert. Methodik: HT-29-Zelllen wurden mit humanen rekombinanten Zytokinen kultiviert. Die HBD-2-mRNA wurde mit semiquantitativer Polymerasekettenreaktion (PCR) zunächst abgeschätzt. Als standardisiertes Screening-Verfahren für Darmbiopsien wurde eine quantitative TaqMan-PCR etabliert. Als absolute Standards wurden cDNA-Abschnitte für HBD-2 und Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase in den Vektor pCR2.1 kloniert. Ein HBD-2-spezifischer Western- blot wurde mit rekombinantem HBD-2 und einem Fusionsprotein aus HBD-2 und der Glutathion-S-Transferase (GST) etabliert. Auf der Basis des Vektors pEGFP wurden rekombinante HBD-2-Fusionsproteine mit dem Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) für die Sekretion bzw. intrazelluläre Expression hergestellt. Die Expression von HBD-2-EGFP durch transfizierte Zellen wurde durchflusszytometrisch über EGFP bestimmt und im HBD-2-spezifischen Western- blot nachgewiesen. Ergebnisse: Interleukin (IL)-1β, nicht aber Tumornekrosefaktor-α, IL-6 bzw. IL-17 induzierte die Expression von HBD-2-mRNA. Obwohl der hochsensitive Western-blot reproduzierbar 1.5 pMole HBD-2 darstellte und die Fusionsproteine HBD-2-EGFP und HBD-2-GST spezifisch nachgewiesen wurden, konnte HBD-2 aus menschlichem Darmgewebe bzw. bei mit IL- 1β-inkubierten HT-29-Zellen nicht gezeigt werden. Wurde rekombinantes HBD-2 gemeinsam mit zellulären Proteinen aufgetragen, waren mindestens 70 pMole HBD-2 für den Nachweis notwendig; Mengen die nach Induktion mit IL-1β bzw. in Darmproben nicht erreicht wurden. Für eine Anreicherung durch Immunpräzipitation von HBD-2 aus Kulturüberständen oder Zelllysaten war der im Western-blot verwendete Antikörper nicht geeignet. Bei einer Transfektionseffizienz um 70% in HT-29 und primären Zellen wurde unter der Kontrolle des HBD-2-Signals exprimiertes HBD-2-EGFP mit einer Größe von ~38 kDa sowohl in Lysaten aus 1×10^5 Zellen als auch aus Kulturüberständen direkt gezeigt. Schlussfolgerung: Die auf Transkriptionsebene in der Zelllinie HT-29 gezeigte Induktion der HBD-2-Expression durch proinflammatorisches IL-1β unterstützt die Annahme, dass die Defensinproduktion nicht nur direkt durch Bakterien, sondern auch indirekt über zellproduzierte Zytokine reguliert wird. Mittels TaqMan-PCR kann die HBD-2-mRNA in Darmbiopsien quantifiziert werden. Die Sensitivität des Western-blots gestattet keinen unmittelbaren Proteinnachweis aus solchen Proben. Mit dem Modell konstitutiv durch transfizierte epitheliale Zellen exprimierter HBD-2-EGFP-Fusionsproteine können Methoden zur Anreicherung und Darstellung des HBD-2-Proteins aus Zelllysaten und Zellkulturüberständen etabliert werden. Die hier bereitgestellten Methoden gestatten den Nachweis von Defensinen auf mRNA- und Proteinebene und können auf Proben menschlicher Darmepithelien übertragen werden.

Background: Altered intestine mucosal barrier and cellular cytokine-mediated immune responses against commensal flora as well as a disordered homoeostasis of defensins are hallmarks in Crohn’s disease. Transcriptionally regulated human β2-defensin (HBD)-2 is expressed and secreted by epithelial cells but the mechanism of its induction is not fully understood. Here the effect of proinflammatory cytokines on HBD-2 expression in the human adenocarcinoma cell line HT-29 as a model for human intestinal epithelial cells was studied at transcriptional and at protein level. Methods: HT-29 cells were incubated with recombinant human pro-inflammatory cytokines. In a semiquantitative approach, cellular HBD-2-mRNA levels were estimated after specific polymerase chain reaction (PCR). For standardized screening of HBD-2 expression in intestinal biopsies, a quantitative TaqMan-PCR was established using cDNA segments of HBD-2 and glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase cloned into the vector pCR2.1 as absolute standards. An HBD-2-specific western-blot was established with recombinant HBD-2 and a fusion protein of HBD-2 with the glutathione-S-transferase (GST). Using the vector pEGFP-HBD-2 was fused to the enhanced green fluorescent protein (EGFP) for secretion or for intracellular expression of the fusion protein. The expression of HBD-2-EGFP by transfected cells was monitored by flow cytometry of EGFP and by HBD-2-specific western- blot. Results: Interleukin (IL)-1β, but not tumor necrosis factor-α, IL-6 or IL-17, induced HBD-2 mRNA in HT-29 cells. Although the highly sensitive western-blot reproducibly detected 1.5 pmoles HBD-2 as validated with the recombinant HBD-2 as well as the fusion proteins HBD-2-EGFP and HBD-2-GST, the western-blot did not show HBD-2 in primary human ileum cells or IL-1β-treated HT-29 cells. Against the background of cellular proteins, 70 pmoles recombinant HBD-2 were necessary to be detected by western-blot; amounts not obtained by induction of HBD-2 expression in HT-29 cells by IL-1β or in intestinal biopsies. The HBD-2-specific antibodies used for Western-blot did not enrich HBD-2 from cell culture supernants or cell lysates in an immunoprecipitation approach. If transfected with the vector pHBD-2-EGFP, 70% of the HT-29 or primary cells expressed HBD-2-EGFP with a size of ~38 kDa and the fusion protein was detected in lysates from 1×10^5 cells as well as from cell culture supernantants. Conclusions: The induction of HBD-2-specific mRNA by IL-1β supports the hypothesis, that defensin production might not only be regulated by exogenous triggers like bacteria but also by cell derived cytokines. At transcriptional level HBD-2 expression in intestinal biopsies can be quantified by TaqMan-PCR. The sensitivity of the western-blot is not sufficient for direct detection of the HBD-2 protein. The model of constitutive expression of a secreted HBD-2-EGFP fusion protein by transfected epithelial cells can help to establish methods for reproducible enrichment and detection the HBD-2 protein from cell lysates as well as from cell culture supernants. The methods provided here allow to assess the quantitative limits for the detection of defensins at transcriptional and translational level and to be used for biopsy samples of the human intestine.