dc.contributor.author
Alsamah, Wisam
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:46:38Z
dc.date.available
2012-04-02T11:45:23.509Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10970
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-15168
dc.description
Acknowledgements 3 Table of contents 5 1 Introduction 9 1.1 The immune system
9 1.1.1 The innate immune system 9 1.1.2 The adaptive immune system 10 1.1.3
Antigen presenting cells 10 1.1.3.1 MHC molecules and antigen presentation 11
1.1.3.2 The MHC class I presentation pathway 11 1.1.3.3 The MHC class II
presentation pathway 13 1.1.3.4 Non-MHC class I and II molecules APMs 14 1.1.4
B cells 14 1.1.5 T cells 14 1.1.5.1 CD8+ αβ TCR+ T cells 16 1.1.5.2 CD4+ αβ
TCR+ T cells 17 1.1.5.3 DN αβ TCR+ T cells 17 1.1.5.4 γδ TCR+ T cells 17
1.1.5.5 NK Tcells 18 1.1.6 NK cells 18 1.1.7 Soluble molecules of the immune
response 20 1.1.7.1 Antibodies 20 1.1.7.2 The complement system 20 1.1.7.3
Cytokines and chemokines 21 1.1.7.4 The cytolytic molecules 22 1.2
Immunotherapy and gene therapy 23 1.2.1 Active immunotherapy 23 1.2.2 Passive
immunotherapy 23 1.2.3 Adoptive immunotherapy 24 1.2.3.1 Specific TCR-loaded
lymphocytes 24 1.2.3.2 Chimeric antigen receptor (CAR)-loaded lymphocytes 25
1.2.3.2.1 First generation of CARs 26 1.2.3.2.2 Second generation of CARs 27
1.3 CAR-modified NK cell-based therapy 28 1.3.1 NK cell-based targeting 28
1.3.2 HER-2 targeting: CAR-NK cell-based therapy versus antibody treatment 30
1.3.3 Direct aims of the thesis 32 2 Materials and Methods 33 2.1 Materials 33
2.1.1 Cell lines 33 2.1.2 pMIG vector 34 2.1.3 Chimeric antigen receptor
constructs 35 2.1.4 Restriction enzymes 36 2.1.5 Antibodies 36 2.1.6 Reagents
37 2.1.7 Kits 38 2.1.8 Buffers and solutions 38 2.1.9 Laboratory material 39
2.1.10 Laboratory devices 40 2.2 Methods 41 2.2.1 Isolation of human
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 41 2.2.2 Expansion of primary human
NK cells 41 2.2.3 Plasmid amplification 42 2.2.3.1 Transformation 42 2.2.3.2
Minipreparation (QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol) 42 2.2.3.3
Maxipreparation (QIAGEN-tip 500 Plasmid Purification Maxi Kit) 43 2.2.4
Retrovirus production by 293T cells 44 2.2.5 Retroviral transduction 45 2.2.6
Cell culture 46 2.2.7 Cell storage 46 2.2.8 Cytotoxicity test 47 2.2.9 Flow
cytometry 47 2.2.10 NKG2D modulation assay 48 2.2.11 T cell depletion 49
2.2.12 Cytokine release assay and ELISA 49 3 Results 50 3.1 Effect of
PBL:feeder cell ratio on NK transduction efficacy 50 3.2 Role of IL-2 in
modulating NK transduction efficacy 52 3.3 Effect of timing and number of
transduction rounds on transduction efficacy 53 3.4 Efficient expression of
the chimeric antigen receptors on engineered NK cells 54 3.5 CAR-engineered NK
cells produce cytokines upon HER-2 recognition 55 3.6 CARz28-NK cells are
resistant to NKG2D blockade 58 3.7 CAR-mediated recognition compares favorably
to trastuzumab mediated NK cell activation. 65 4 Discussion 69 4.1 Design of
CAR-loaded human primary NK cells 69 4.2 Impact of NKG2D down-modulation on
CAR-modified NK cells recognition 70 4.3 Targeting efficacy of CAR-modified NK
cells and trastuzumab 71 4.4 CAR-modified NK cells provide a promising
approach to treat established tumors 73 5 Summary 74 6 Deutschsprachige
Zusammenfassung 75 7 References 76 8 Appendix 85 8.1 Abbreviations 85 8.2 List
of Figures and Tables 88 Publication 93 Curriculum Vitae 94
dc.description.abstract
Natural killer (NK) cells express an array of activating cell surface
receptors that can trigger cytolytic programs, as well as cytokine or
chemokine secretion, which suggesting them as promising effectors for tumor
adoptive therapy. I identified the optimal conditions for expanding and
transducing human primary NK cells. Next, I engineered NK cells with chimeric
antigen receptors (CARs) specific for HER-2, a tumor-associated antigen
frequently overexpressed by many tumors of epithelial origin, providing them
with tumor-antigen targeting specificity. I compared first and second
generation CARs including a stimulatory (CD3ζ) signaling domain alone or
together with a co-stimulatory (CD28) signaling domain. I found that co-
stimulatory signaling significantly improved IL-2 production by NK cells.
Blocking of NKG2D by its soluble ligand, which is known to reduce NK cell
responsiveness, did not impact CAR-mediated HER-2 specific recognition by
these cells. Comparing CAR targeting of NK cells to soluble antibody
(trastuzumab) targeting revealed that breast carcinoma without HER-2 gene
amplification can be uniquely targeted by CAR-modified NK cells. Thus, the
direct coupling of the antibody specificity to NK cells functions mediated by
CAR expression resulted in superior NK cell targeting via CD16 binding of
soluble monoclonal antibodies.
de
dc.description.abstract
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) exprimieren eine Vielzahl aktivierender
Oberflächenrezeptoren, die sowohl zytolytische Prozesse, als auch die
Sekretion von Cytokinen und Chemokinen auslösen können. Diese Eigenschaften
lassen NK-Zellen als aussichtsreiche Effektoren der adoptiven Tumortherapie
erscheinen. Im Verlauf meiner Arbeit optimierte ich die Bedingungen zu
Kultivierung, Expansion und Transduktion primärer humaner NK-Zellen. Im
Folgenden konstruierte ich NK-Zellen mit HER-2-spezifischen chimären Antigen-
Rezeptoren (CARs). HER-2 ist ein tumor-assoziertes Antigen, welches in vielen
Tumoren epithelialen Ursprungs überexprimiert wird und diese dadurch mit einer
Targeting-Spezifizität gegen Tumor-Antigen ausstattet. Beim Vergleich der
ersten und zweiten CAR-Generation, die entweder lediglich eine CD3ζ-
signalstimulierende Domäne oder zusätzlich eine kostimulierende CD28-Domäne
enthielten, fand ich eine signifikante Erhöhung der IL-2-Produktion in NK-
Zellen durch die Kostimulation. Die Blockierung von NKG2D durch seine
löslichen Liganden, die üblicherweise zu einer Reduktion der
Ansprechempfindlichkeit der NK-Zellen führt, hatte keinen Einfluss auf die
CAR-vermittelte HER-2-spezifische Erkennung dieser Zellen. Der Vergleich
zwischen CAR-Targeting von NK-Zellen und löslichen Antikörpern (Trastuzumab)
zeigte, dass Brustkarzinome ohne HER-2-Genamplifikation durch CAR-modifizierte
NK-Zellen angesprochen werden können. Die direkte Kopplung der Antikörper-
Spezifität mit der Funktion der NK-Zellen durch die Expression von CARs
resultierte in überlegenem NK-Zell-Targeting mittels der Bindung gelöster
monoklonaler Antikörper durch CD16.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
tumor immunology
dc.subject
CAR, trastuzumab
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Chimeric antigen receptor-modified NK cells target breast carcinomas resistant
to soluble antibody treatment
dc.contributor.contact
walsamah@yahoo.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Markus Wahl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Tina Romeis
dc.date.accepted
2011-03-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000021603-2
dc.title.translated
Chimäre-antigen-rezeptor-modifizierte NK-Zellen erreichen
antikörperbehandlungsresistente Brustkarzinome
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000021603
refubium.note.author
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FUDISS_derivate_000000009179
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