Einfluss von autologen mesenchymalen Stammzellen auf eine Pseudarthrose unter besonderer Beachtung der periostalen Rekonstruktion: Eine immunhistologische und histomorphometrische Studie im Rattenmodell

Abstract

Schwerwiegende Frakturen mit umfangreichen Knochendefekten, verzögerter Frakturheilung, Pseudarthrosen sowie Wundinfektionen sind trotz Fortschritts in der Medizin ein bestehendes Problem. Pseudarthrosen und verzögerte Knochenheilungen erfordern häufig eine langwierige und letztendlich nicht immer erfolgreiche Behandlung des Patienten. Dadurch entstehen einerseits massive Einschränkungen der Lebensqualität des Patienten und andererseits erhebliche Mehrkosten für das Gesundheitssystem durch zusätzliche Operationen, verlängerte Krankenhausaufenthalte und Nachbehandlungszeiten. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die lokale Applikation von autologen mesenchymalen Stammzellen und ihre Fähigkeit zur Aktivierung des Heilungspotentials in einer atrophe Pseudarthrose Situation untersucht. Desweiteren wurde die Wiederherstellung der periostalen Integrität als Voraussetzung für eine physiologisch verlaufende Frakturheilung der Röhrenknochen und eine Beteiligung der lokal applizierten MSCs am Reparationsprozess untersucht. In der vorliegenden kontrollierten Studie wurden 16-20 Wochen alte, männliche, 410-460g schwere Sprague Dawley Ratten verwendet. Die Tiere wurden einseitig am linken Hinterbein standardisiert osteotomiert und mit einem Fixateur externe versorgt. Um eine atrophe Pseudarthrosesituation zu schaffen, wurde das Periost auf einer Länge von 2 mm proximal und distal der Osteotomie durch Kauterisierung zerstört und das Knochenmark entfernt. Zwei Tage post Osteotomie wurden bei der Versuchsgruppe (MSC-Gruppe) 2 x 106 MSCs/100 μl Zell-Mediumsuspension perkutan in den Osteotomiespalt injiziert. Die Kontrollgruppe (Medium-Gruppe) erhielt die analoge Menge des Kultivierungsmediums ohne Zellen. Die Anzahl der Tiere pro Gruppe betrugen 16. Radiologische Verlaufskontrollen erfolgten in wöchentlichen Intervallen. Die Tiere wurden nach acht Wochen euthanasiert, die Femora präpariert, histologisch, immunhistologisch sowie histomorphometrisch untersucht. Radiologisch und histologisch wurde in beiden Gruppen ein verzögerter Heilungsverlauf beobachtet. Die histologischen Bilder beider Gruppen ähnelten sich. Der periostale Kallus endete bei der Mehrzahl der Tiere im gekauterten Bereich. Nur bei wenigen Tieren überbrückte der periostale Kallus den Osteotomiespalt, oft nur auf einer Seite bzw. von einem Osteotomieende ohne Verbindung zum gegenüberliegenden periostalen Kallus oder der gegenüberliegenden Kortikalis zu erlangen. Vereinzelt kam es in beiden Gruppen zu einer Überbrückung des Osteotomiespalts durch den endostalen Kallus. Eine Schicht aus dicken Bindegewebsfasern, bei der es sich höchstwarscheinlich um das Stratum Fibrosum handelt, darunter vereinzelt zu beobachten eine Schicht aus mehrreihigen Zellen, vermutlich das Stratum Cambrium, überzog in beiden Gruppen den periostalen Kallus und bei einigen Tieren sogar den Osteotomiespalt. Das Stratum fibrosum mit dem sich vermutlich entwickelnden Stratum cambium war nur vorzufinden, wo auch mineralisiertes Gewebe war. In beiden Gruppen zeigte sich eine signifikante Zunahme der Osteotomiespaltweite sowohl auf der lateralen Seite als auch auf der medialen Seite. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen bezüglich der prozentualen Anteile mineralisierten Knochens und Knorpel festgestellt werden. Der Anteil Bindegewebe an der Gesamtfläche dagegen zeigte sich bei den Tieren der Mediumgruppe signifikant größer. Die Tiere der Medium-Gruppe zeigten eine signifikant größere Anzahl der Gefäße als auch eine größere Dichte der Gefäße pro Quadratmillimeter Bindegewebsfläche als die Tiere der MSC-Gruppe. Signifikante Unterschiede in der Osteoklastenanzahl ließen sich weder im periostalen und endostalen Kallus noch in der lateralen und medialen Kortikalis feststellen. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie und dem heutige Stand der Forschung wird ersichtlich, dass undifferenzierte perkutan applizierte mesenchymale Stammzellen allein nicht in der Lage sind, kritisch ablaufende Knochenheilungen positiv zu beeinflussen oder einen positiven Einfluss auf die periostale Rekonstruktion auszuüben. Schlussfolgernd wird ersichtlich, dass eine osteogene Ausdifferenzierung bzw. eine Unterstützung der MSCs in Richtung der osteogenen Differenzierung, bzw. eine Applikation der Zellen zu einem anderen Zeitpunkt unter der Zuhilfenahme spezieller Trägermaterialien oder Zellverbänden einen größeren Erfolg verspricht. Auch die periostale Regeneration konnte durch die applizierten MSCs nicht beeinflusst werden. Vielmehr scheint die periostale Regeneration an die Entwicklung eines knöchernen Kallus gebunden zu sein.

Despite constant developments in the field of medicine, severe fractures with extensive bone loss, delayed fracture repair, nonunions as well as infections, still represent a treatment challenge. Nonunions and delayed fracture repair often require a long and dissatisfying treatment. Throughout this process, life quality of the patient is restricted, additional operations and prolonged hospital residence will raise the national health system costs. Based on these facts the objective of this thesis was to examine the ability of autologous mesenchymal stem cells (MSCs) to activate the healing potential when applied in a case of atrophic nonunion. Furthermore it was examined whether the restoration of the periosteal integrity is a precondition for a physiological long bone fracture repair and which influence local application of MSC has on the bone repair process. In this study 16 to 20 week old male Sprague Dawley rats were used, with a weight of 410 to 460 g. They were divided in two groups, the mesenchymal stem cells group (MSC-group) and the control group (medium-group), with 16 rats in each group. Both groups underwent a standard osteotomy on the left os femoris and were subsequent treated with an external fixator. Distal and proximal to the osteotomy site, the periosteum was cauterised for a length of 2 mm plus bone marrow removal in order to achieve an atrophic nonunion. Two days after osteotomy 2 x 106 MSCs/100 μl cell- mediumsuspension were injected in the osteotomy gap percutaneously in the animals of the MSC-group. A corresponding amount of culture medium without cells was applied to the medium-group. The healing process was radiologically controlled at weekly intervalls. 8 weeks post osteotomy the animals were euthanisied, their femora were prepared and histologically, immunehistologically and histomorphometrically examined. Delayed healing was observed in both groups, radiologically as well as histologically. The histological pictures of both groups were similar. In most of the cases there was no periosteal callus development in the cauterized area. Only in a few animals the periosteal callus grew across the osteotomy gap. In most of the cases the periosteal callus reached just from one end of the osteotomy to the opposite side, but without connecting to the other side. Just in isolated cases the osteotomy gap was bridged completely by the endosteal callus. A layer of large connective tissue fibres, probably the stratum fibrosum, which covered a single layer of muliple-row cells, possibly the stratum cambrium, was identified in both this groups. This new build periosteum covered the periosteal callus and was in single animals even crossing the osteotomy gap. In both groups a significant increase in the width of the osteotomy gap was determined, on the lateral side as well as on the medial side, but there was no significant difference concerning the increase of the width between the groups. No significant difference could be found between the groups concerning the procentual fraction of mineralized bone and cartilage. On the contrary, the fraction of connective tissue on the total area was significantly higher in the medium-group and this group also showed a higher number of vessels, as well as a higher amount of vessels per square millimeter connective tissue compared to the MSC-group. No significant differences could be determined concerning the number of osteoclasts, neither in the periosteal and endosteal callus nor in the lateral or medial corticalis. The results of this study and current state of research show, that undifferentiated percutaneously applied mesenchymal stem cells alone are not able to influence critical bone healing positively. In conclusion it becomes obvious, that a complete osteogenic differentiationor a support of MSCs towards osteogenic differentiation or an application of the cells at a different time point aided by special scaffolds or cell sheets might be more successful. The applicated MSCs couldn`t stimulate the periosteal regeneration as well. It rather seems that the periosteal regeneration is dependent on the development of a bony callus.