Untersuchungen zur funktionellen Rolle von CD2BP2 in der CD2-vermittelten Signaltransduktion von T-Zellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob das Protein CD2BP2 an der CD2-vermittelten Weiterleitung von Signalen in humanen peripheren T Zellen beteiligt ist. Dazu wurden in einem ersten Schritt siRNA-Oligonukleotide charakterisiert, die die Expression von FLAG CD2BP2 in Jurkatzellen suffizient unterdrückten. Unter Verwendung fluorophormarkierter CD2BP2 siRNA wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie gezeigt, daß praktisch alle eingesetzten humanen peripheren Blutzellen (PBMCs) mit der CD2BP2 siRNA transfiziert werden konnten. Die mit CD2BP2 siRNA transfizierten PBMCs wurden anschließend funktionellen Tests unterzogen. Dafür wurden die PBMCs mit CD2 Antikörpern in Anwesenheit von PMA stimuliert. Einerseits wurden die Zellen anschließend durchflußzytometrisch analysiert. Hierbei wurden die Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 sowie der Zytokine IL-2, IFNγ und IL-10 untersucht. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die siRNA-behandelten Zellen keine Veränderungen bezüglich CD69, IL-2, IFNγ und IL-10. In dieser ersten Meßreihe sollte nach deutlichen funktionellen Defekten nach CD2BP2-Knockdown gesucht werden. Da hierbei keine deutlichen Veränderungen gefunden werden konnten, wurde in einer zweiten Meßreihe die Meßgenauigkeit der Durchflußzytometrie deutlich erhöht, um auch subtilere Veränderungen messen zu können. Hierbei wurde auf das Interleukin-2 fokussiert. Allerdings konnten auch hierbei keine Veränderungen gemessen werden. Die gefundenen Ergebnisse hinsichtlich der Zytokinantwort der CD2BP2-defizienten T Zellen wurden mit einer alternativen Meßmethode überprüft. Dazu wurden CD2BP2 siRNA-Transfektanten entweder mit CD2 Antikörpern in Anwesenheit von PMA oder ausschließlich mit CD2 Antikörpern stimuliert und kultiviert. Die Menge an IL-2 in den Kulturüberständen wurde im ELISA bestimmt. Auch hier zeigte sich kein Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und den CD2BP2-defizienten T Zellen. Zusammengefaßt kann festgestellt werden, daß keinerlei Beteiligung von CD2BP2 an der CD2-vermittelten Signalweiterleitung hinsichtlich der Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 sowie der Zytokine IL-2, IFNγ und IL-10 gefunden werden konnte. Damit muß in Frage gestellt werden, ob CD2BP2 überhaupt an der CD2-Signaltransduktion beteiligt ist und seine zelluläre Funktion nicht eher in anderen Kontexten wie dem Splicing zu suchen ist.

Exploration of cellular signal transduction pathways has already facilitated major further developments of therapies in modern medicine. At the same time comprising immunological aspects into pathogenetic models of diseases like infections, cancer or autoimmunity helped to create novel therapies as well. Research of signal transduction pathways in T cells led to the development of valuable drugs that are applied to treat autoimmune diseases or that are used in transplantation medicine. Proper activation of T cells depends on several signals mediated by several receptors. Besides the T cell receptor an important class of so called accessory molecules is contributing to proper activation of T cells. One important accessory molecule is CD2. The molecular basis of intracellular CD2 signal transduction is under intensive investigations. So far several proteins are identified and functionally characterized that have the potential to interact with the cytoplasmic domain of CD2. Some of them are directly involved in mediating CD2 signals in T cells. Others were shown later on to play important roles in completely different tissues as well. One of these CD2 interacting proteins is CD2AP. Similar to CD2AP another CD2 interacting protein was identified called CD2 binding protein 2 (CD2BP2). Firstly little was known about the precise functional role of CD2BP2. A first hint came from an initial experiment. Therein CD2 mediated activation of Jurkat T cells overexpressing a GYF-domain containing fragment of CD2BP2 led to an increased interleukin-2 response. On the basis of this experiment it was hypothesized, that CD2BP2 is a component of CD2 mediated interleukin-2 response in T cells. The aim of the current work was to test whether this functional model holds true for the role of endogenous, full length CD2BP2 in primary PBMCs/ T cells. Moreover it should be tested, whether there is evidence, that CD2BP2 is mediating additional CD2-signals leading to the expression of cytokines like interferon γ or interleukin-10 or the early activation marker CD69. By utilizing the RNA interference technique CD2BP2 reduced expressing human PBMCs/ T cells were generated, stimulated via CD2 and tested for functional defects regarding their interleukin-2, interferon γ, interleukin-10 and CD69 response. Cytokine and CD69 responses were characterized by flow cytometry and/or ELISA. As a result no evidence could be found that reduction of CD2BP2 expression in human PBMCs/ T cells leads to defects in CD2 mediated T cell responses regarding interleukin-2, interferon γ, interleukin-10 and CD69 expression. Accordingly the original hypothesis regarding the functional role of CD2BP2 could not be further confirmed. Meanwhile it was found out by others, that CD2BP2 is identical to the protein U5 snRNP 52K, a component of the spliceosome. Hence it can be concluded that at least a central role of CD2BP2 in CD2 mediated signal transduction in primary PBMCs/ T cells is debatable. Interesting alternativ functional roles of CD2BP2 have to be factored into further investigations as well.