Genetische und epigenetische Veränderungen des PAX8-Gens in follikulären Schilddrüsenkarzinomen

Abstract

Hintergrund und Fragestellung: PAX8 spielt als Transkriptionsfaktor eine bedeutende Rolle in der Entwicklung der Schilddrüse und der Differenzierung der Schilddrüsenzellen. Eine Herabregulation der PAX8-Expression ist für epitheliale Schilddrüsenkarzinome beschrieben, Veränderungen auf chromosomaler Ebene sind mit dem PAX8-PPARG1-Fusionsgen für follikuläre Schilddrüsenkarzinome (FTC) und follikuläre Schilddrüsenadenome (FTA) mehrfach publiziert. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob in follikulären Schilddrüsenkarzinomen Veränderungen auf genetischer oder epigenetischer Ebene vorliegen, die zu einer Einschränkung der PAX8- Funktion führen und damit tumorprogressiv wirken könnten. Material und Methoden: 19 Proben follikulärer Schilddrüsenkarzinome wurden untersucht. Zunächst erfolgte die Untersuchung auf Vorliegen des PAX8-PPARG1-Fusionsgens durch Amplifikation aus cDNA mit fusionsgensspezifischen Primern und anschließender Sequenzierung. Das Mutationsscreening auf PAX8-Punktmutationen wurde mittels genomischer Sequenzierung von Exon 2-12 durchgeführt. Der Methylierungszustand von PAX8 wurde mit Hilfe der Bisulfitbehandlung und anschließender Direktsequenzierung untersucht. Ergebnisse: In einer Tumorprobe wurde das PAX8-PPARG1-Fusionsgen nachgewiesen. Eine PAX8-Punktmutation konnte in keiner der Tumorproben gefunden werden. Der Methylierungszustand des PAX8-Gens wurde in der Region –1, die sich 5´ von Exon1 befindet sowie im Fragment 1-1 und 1-3 der CpG-Insel 1 untersucht. CpG-Insel 1 befindet sich im Bereich von Exon 1 und 2, Fragment 1-1 liegt hierbei im vermuteten Promotorbereich von PAX8. Region –1 und Fragment 1-3 waren in allen Tumorproben hypomethyliert und weisen somit keinen Unterschied zu Schilddrüsennormalgewebe oder Kontrollgewebe (Lymphozyten und Wangenschleimhaut) auf. Fragment 1-1 liegt in Schilddrüsennormalgewebe hypomethyliert vor, in den Kontrollgeweben findet sich hier eine Hypermethylierung. Die Hälfte der untersuchten Tumorproben wiesen in Fragment 1-1 eine Hypermethylierung auf und zeigen somit einen Verlust der schilddrüsenspezifischen Hypomethylierung. Schlussfolgerung: Mit der im vermuteten Promotorbereich von PAX8 vorhandenen Fehlmethylierung konnte eine mögliche Ursache für die bereits in der Literatur beschriebene Herabregulierung der PAX8-Expression in FTCs gefunden werden. In Bezug auf TG, dessen Expression unter Einfluss von PAX8 steht, führt das PAX8-PPARG1-Fusionsgen zu ähnlichen Veränderungen, wie sie in FTCs unabhängig vom Vorliegen eines Fusionsgens beschrieben sind. Vor dem Hintergrund der Bedeutung von PAX8 für die Schilddrüsenentwicklung und der Differenzierung der Schilddrüsenzellen, ist es durchaus vorstellbar, dass eine Einschränkung der PAX8-Funktion zu einem Missverhältnis in der Regulation weiterer Gene kommt, was wiederum eine veränderte Signaltransduktion und ein verändertes Wachstum von Zellen nach sich ziehen könnte.

Background and aim: The transcription factor PAX8 plays a important role in the developement of the thyroid gland and differentiation of thyorid cells. A decrease of PAX8 expression is described for epithelial thyroid carcinomas. An important chromosomal translocation in follicular thyroid carcinomas (FTC) and follicular thyroid adenomas (FTA) is the PAX8-PPARG1-fusion gene. It was investigated if there are genetic or epigenetic changes in follicular thyroid carcinomas, that could modify PAX8 function with the consequence of tumorprogression. Material and methods: 19 samples of FTCs were analyzed. The amplification and sequencing for detection of PAX8-PPARG1 fusion gene was carried out with cDNA using primers specific for fusion gene. Screening for PAX8 mutation was estimated by genomic sequencing of PAX8 gene in exon 2 to 12. Methylation level of PAX8 was examined by bisulfit treatment followed by direct sequencing. Results: The PAX8-PPARG1 fusion gene was detected in one tumor sample. No PAX8 mutation was found. Methylation level of PAX8 gene was investigated in region –1 5´ of exon 1 as well as fragment 1-1 and 1-3 of CpG- island 1. CpG-island 1 is situated in exon 1 and 2 of PAX8 gene. Fragment 1-1 is located in the area that is supposed to be the promoter of PAX8. All tumor samples was hypomethylated in region –1 and fragment 1-3. Therefore no abnormalities were found compared with normal thyoid tissue or contoll tissue (lymphocytes and oral mucosa). Fragment 1-1 is hypomethylated in normal thyroid tissue but hypermethylated in controll tissue. Half of the tumor samples were hypermethylated in fragment 1-1. Therefore these tumor samples show loss of thyroid specifc hypomethylation in fragment 1-1. Conclusion: Loss of thyroid specific hypomethylation in fragement 1-1 of PAX8 could be the reason for reported decrease of PAX8 expression in FTCs. Downregulation of TG that is controlled by PAX8 is caused by PAX8-PPARG1 fusion gene but can also be found indipendently of the fusiongene in FTCs. Considering the importance of PAX8 in thyroid development and differentiation of thyroid cells it could be possible that a decrease of PAX8 function cause disproportions in regulation of further genes that leads to modified signal transduction and modified growth of cells.