Application of IL-4 transgene expression in a chondrocyte-based 3D model of inflammatory arthritis

Abstract

Osteoarthritis (OA) is an imperative ailment in humans as well as in veterinary species especially dogs. Dogs constitute a good biological system to study human diseases because they suffer many diseases analogous to that of humans including OA. Chondrocytes, being the sole cell type in cartilage, are the solitary target of cytokines and other mediators involved in pathogenesis of OA. Among these cytokines, IL-1β and TNFα are two master pro-inflammatory cytokines whereas IL-4 is a major player with anti-inflammatory properties. Taking into consideration the chondrocyte biology and the cytokine hierarchy in OA, the present study was aimed at characterization of chondrocytes to develop a model of inflammatory arthritis where the anti-inflammatory capacity of IL-4 was to be monitored. Isolated chondrocytes were grown in monolayer (2D) and in alginate-based 3D culture systems. Several morphological, biochemical, and functional features of chondrocytes were examined by immunocytochemistry, western blot and quantitative real time PCR. Attempts were made to generate a chondrocyte cell line by using human telomerase reverse transcriptase. Canine recombinant cytokines (IL-1β and TNFα) were cloned and their purified proteins used as exogenous stimulants in chondrocyte cultures. The expression of typical inflammation markers such as pro- inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8, GM-CSF and TNFα), enzyme mediators (MMP-3, MMP-13, iNOS, COX-2) and their catabolites (NO, PGE2) was measured. IL-4 was transfected in chondrocytes in both culture systems followed by stimulation with IL-1β and TNFα to study its anti-inflammatory activity. IL-4 protein was detected by Western blot, and an ELISA system was developed for its quantification. Results show that chondrocyte rapidly lose their characteristic phenotype in serial monolayer culture. This de-differentiation could be reverted by encapsulation of cells in alginate beads. Immortalized chondrocytes were able to produce chondrocyte specific markers in 3D culture but further studies were hampered due to their non-responsiveness to cytokines. Cytokine stimulation of chondrocytes resulted in high expression of all inflammatory markers. Western blot results showed IL-4 as a 17 kDa protein in transduced chondrocytes. The detection level for IL-4 as measured by ELISA was found to be about 3 ng ml-1. The IL-4 expressed in chondrocytes was found to be biologically active since it was capable of inhibiting the selected inflammatory markers in the transduced chondrocytes. Since high expression of STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6) was seen almost exclusively in cells expressing IL-4, it is therefore assumed that IL-4 exerts its anti-inflammatory effects through STAT6 signaling. The canine form of STAT6 was identified and partially cloned and sequenced. Avenues are open to further characterize this signal molecule. These findings altogether provide a solid foundation to validate constructs with cytokine-responsive “intelligent” promoters, which were developed in this laboratory alongside experimental work for this thesis. Thus, using the 3D culture systems described here it was shown that only in the presence of inflammation, the expression of IL-4 is driven in a sophisticated and fine-tuned manner. Thus, combining the above 3D culture system with the application of regulatable delivery of transgenes such as IL-4 or other promising candidate genes will facilitate further development and testing of novel gene therapy strategies against OA.

Osteoarthritis (OA) ist eine ernste Erkrankung beim Menschen wie auch bei veterinärmedizinisch relevanten Säugetieren. Hunde stellen ein gutes biologisches System auch zur Untersuchung menschlicher Krankheiten dar, weil diese vielfach analog zu denen beim Menschen verlaufen. Dies gilt insbesondere auch für die OA. Chondrozyten sind als alleiniger Zelltyp des Knorpels die einsamen Ziele von Zytokinen und anderen Mediatoren, die bei der Pathogenese der Arthrose auf dies Gewebe wirken. Unter diesen Zytokinen stellen IL-1β und TNFα die „Hauptakteure“ unter den pro-inflammatorischen Zytokinen dar während IL-4 als Gegenspieler mit entzündungshemmenden Eigenschaften angesehen wird. Unter Berücksichtigung der Biologie sowie der bekannten Hierarchie der Zytokine von Chondrozyten im Kontext der OA, wird in der vorliegenden Studie die Charakterisierung caniner Chondrozyten vorgenommen mit dem Ziel, ein zellkulturbasiertes Modellsystem der inflammatorischen Arthritis zu entwickeln, mit dessen Hilfe die anti-inflammatorische Kapazität des Interleukin-4 (IL-4) untersucht werden sollte. Isolierte Chondrozyten wurden in Monolayer Kulturen gezüchtet und in ein Alginat-basiertes dreidimensionales (3D) Gewebesystem überführt. Eine Anzahl verschiedener morphologischer, biochemischer und funktioneller Parameter dieser vom Hund stammenden Chondrozyten wurde mit Hilfe der Immunzytochemie, des Western-Blots und der quantitativen Real-Time-PCR gemessen. Es wurde ein erfogreicher Versuch unternommen, unter Verwendung der klonierten menschlichen Telomerase-Reverse- Transkriptase eine (immortalisierte) canine Chondrozyten-Zelllinie zu etablieren. Zur Verwendung im angestrebten in vitro Entzündungsmodell wurden die Zytokine IL-1β und TNFα des Hundes kloniert und sequenziert, in E. coli exprimiert, charakterisiert und aufgereinigt. Die Ausprägung der typischen Entzündungsmarker wie pro-inflammatorische Zytokine (IL-1β, IL-6, IL-8, GM- CSF, TNFα), Enzyme des Entzündungsgeschehens (MMP-3, MMP-13, iNOS, COX-2) und deren Kataboliten (NO, PGE2) wurden gemessen. IL-4 wurde in mit IL-1β und TNFα stimulierten und transfizierten Chondrozyten in beiden Kultursystemen (2-D und 3-D) auf seine anti-entzündliche Aktivität hin untersucht. Das in diesen caninen Zellkulturen exprimierte IL-4-Protein wurde nach PAGE von Lysaten im Western-Blot nachgewiesen und ein ELISA-System zu dessen Quantifizierung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass Chondrozyten in der Monolayerkultur (2-D) schnell ihren charakteristischen Phänotyp verlieren. Diese Entdifferenzierung konnte durch die Verkapselung der Zellen in Alginat-Perlen (3-D Kultur) wieder revertiert werden. Immortalisierte Chondrozyten waren in der 3D-Kultur ebenfalls in der Lage, Chondrozyten-spezifische Marker zu exprimieren. Die Verwendung dieser Chondrozyten Zelllinie als in vitro Entzündungsmodell gelang aber nicht, weil diese Zellen nicht mehr auf die Behandlung mit pro-inflammatorischen Zytokinen reagierten. Dieselbe Stimulation normaler Chondrozyten führte dagegen zu einer hohen Expression aller ausgewählten Entzündungsmarker. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass IL-4 in transduzierten Chondrozyten als 17 kDa-Protein vorliegt. Die im ELISA ermittelte Nachweisgrenze für IL-4 beträgt etwa 3 ng ml-1. Das in transduzierten Chondrozyten exprimierte IL-4 erwies sich als biologisch aktiv, denn es bewirkte eine starke Hemmung der ausgewählten Entzündungsmarker. Da ausschließlich in den Zellen, die IL-4 exprimieren, auch eine hohe Expression von STAT6 (Signal Transducer und Aktivator der Transkription 6) beobachtet wurde, wird angenommen, dass IL-4 seine anti-entzündliche Wirkung über den Signalweg des STAT6 entfaltet. In diesem Zusammenhang wurde die canine Form des STAT6 identifiziert, teilweise kloniert und sequenziert. Die weitere Charakterisierung dieses Signalproteins ist in unserem Labor im Gange. Insgesamt liefern diese Erkenntnisse ein solides Fundament zur Validierung von neuartigen Expressionsvektoren mit zytokinsensitiven, „intelligenten“ Promotoren, die parallel zu den experimentellen Arbeiten für diese Dissertation entwickelt wurden. So konnte mit dem hier beschriebenen 3D-Kultur Systeme bereits gezeigt werden, dass bei Verwendung solcher Konstrukte die Expression von IL-4 nur in einem Entzündungsmilieu erfolgt. Die Kombination des oben genannten 3D-Kultur-Systems caniner Chondrozyten mit der Anwendung der entzündungsregulierten Expression von therapeutischen Transgenen wie IL-4 oder anderen Kandidaten-Gene kann für die Entwicklung und Testung neuer Gen- Therapie-Strategien gegen OA (und RA) nützlich sein.