Expression und Funktion Endothelin-Konvertierungsenzym-1 regulierender Transkriptionsfaktoren in humanen neuroepithelialen und meningealen Tumoren

Abstract

Die schlechte Prognose höhergradiger Astrozytome erklärt die intensive Suche nach neuen therapeutischen Zielstrukturen. Das Endothelinsystem wurde funktionell in zahlreichen extrazerebralen Tumoren mit Proliferation, Angiogenese oder Apoptosehemmung assoziiert. Endothelin-Konvertierungsenzyme (ECE) sind für die Synthese der Endotheline von entscheidender Bedeutung. Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der transkriptionellen Regulation von ECE-1. Das Ziel war es, in humanen glialen und meningealen Tumoren sowie in Zelllinien glialen, endothelialen und neuroblastären Ursprungs mittes EMSA, Southwestern Blot und Reportergen-Assay Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die mit den isoformspezifischen Promotoren von ECE-1c und ECE- 1b interagieren können. Es ergaben sich die folgenden Ergebnisse und Schlussfolgerungen: 1\. E2F 1, -2 und variabel auch -3 werden in den untersuchten Hirntumoren exprimiert. Von diesen interagiert nur E2F-2 spezifisch mit den E2F-Bindungsmotiven im ECE-1b und -1c Promotor. Die Ergebnisse stützen das in der Literatur diskutierte Konzept, dass die aktivierenden E2F-Familienmitglieder auch individuelle Zielgene haben können. Der Rb-Signaltransduktionsweg ist häufig in Glioblastomen alteriert. Dies führt zu einer gesteigerten Freisetzung von E2F und Transkription von E2F- Zielgenen. Eine indirekte Zielstruktur des alterierten Rb Signaltransduktionswegs könnte ECE sein. 2\. Die Affinität von E2F-2 zum ECE- 1b Promotor wird durch einen natürlichen Polymorphismus beeinflusst, dessen Bedeutung für das Risiko oder die Progression von Hirntumoren noch unbekannt ist. 3\. Der Transkriptionsfaktor CBF interagiert ebenfalls spezifisch mit dem ECE-1c Promotor. Dies deutet darauf hin, dass der ECE-1c Promotor sowohl durch E2F-2 als auch durch CBF reguliert werden kann. Eine gemeinsame Regulation durch CBF und E2F wurde bereits für andere Gene beschrieben. 4\. Die Wichtigkeit des E2F-Bindungsmotivs im ECE-1c Promotor konnten wir mittels Reportergen Assay bestätigen. Durch Mutation des E2F-Bindungsmotivs reduziert sich die Promotoraktivität auf 16% der Wildtyp-Aktivität. Überexpression von E2F-2 führte zu einer weiteren Steigerung der Promotoraktivität. Allerdings ließ sich eine verminderte Bindung von E2F-2 an das mutierte Promotorelement im EMSA nicht nachweisen und auch die Überexpression von E2F-1 erhöhte die Promotoraktivität. 5\. Aus Tumorproben isolierte Proteine zeigten eine individuell variable Bindungsstärke von E2F-2 zum ECE-1c Promotor. Dies könnte durch Unterschiede in der Expression postulierter E2F-2 Varianten bedingt sein. Eine höhere Bindungsstärke zum ECE-1c Promotor war mit der Expression einer ca. 50 kDa großen E2F-2 Variante verbunden. Im Southwestern Blot zeigte sich eine Bindung der dem Promotorelement entsprechenden DNA-Sequenz nur an ein 50 kDa großes Protein, obwohl neben einer 50 kDa großen Variante von E2F-2 weitere Varianten detektierbar waren. Da die Ergebnisse auf der Untersuchung einer kleinen Anzahl von sehr verschiedenen Tumoren basieren, empfehlen wir die Überprüfung an weiteren histologisch klassifizierten Hirntumoren. Weiterführende Untersuchungen unter Einbeziehung der Chromatinstruktur für die biologische Relevanz der erhobenen Daten wären von Interesse.

Due to the poor prognosis of malignant astrocytic tumours, novel therapeutic targets need to be identified. The endothelin system has been shown to increase proliferation, tumour invasion and angiogenesis and to decrease apoptosis. Endothelin-converting enzymes (ECEs) are essential for the synthesis of biologically active endothelin. Here, we investigated mechanisms of transcriptional regulation of ECE-1 in brain tumours. We sought to identify transcription factors interacting with isoform specific promoters of ECE-1b and -1c in human glial and meningeal tumours as well as in glial, endothelial and neuroblastic cell lines by EMSA, Southwestern blot, and reportergene assay. We obtained the following results and drew conclusions: 1\. Although E2F-1, E2F-2 and in most cases also E2F-3 were expressed by the investigated brain tumours, E2F-2 interacted specifically with the E2F binding site in the ECE-1b and -1c promoter. These results support the concept that the activating members of the E2F family can have individual target genes. The Rb signal transduction pathway is altered in many glioblastomas causing an increased liberation of E2F which in turn activate transcription of target genes. The specific interaction of E2F-2 with E2F binding sites in ECE-1b and -1c promoter observed in this work suggests that ECEs are indirect targets of an altered Rb pathway. 2\. The affinity of E2F-2 to the ECE-1b promoter is influenced by a natural polymorphism. Whether this polymorphism influences the brain tumour risk remains to be determined. 3\. We could also show that transcription factor CBF interacts specifically with the ECE-1c promoter. Therefore, ECE-1c is probably regulated by at least two transcription factors, E2F-2 and CBF. Previously, these factors have been shown to cooperate in regulating other genes. 4\. By reportergene assays, we were able to demonstrate that the E2F binding site is functionally important for promoter activity. In microvascular endothelial cells, mutation of this site decreased promoter activity to 16% compared to wild-type activity. Overexpression E2F-2, but also of E2F-1 by transient co-transfection significantly increased wild- type promoter activity. However, decreased binding affinity of E2F-2 to mutated E2F binding site was not observed in EMSA experiments. 5\. Proteins isolated from tumour tissue showed variable binding affinity of E2F-2 to the ECE-1c promoter. These differences might be explained by expression of different postulated E2F-2 variants. Higher binding affinity was associated with expression of a 50 kDa E2F-2 variant. In Southwestern blot experiments, binding was restricted to a 50 kDa protein although other proteins were detected by the anti-E2F-2 antibodies. Since this study was performed with a limited numbers of tumours of different entities, we suggest that more more samples of histologically classified brain tumours should be investigated to verify the results. Further experiments allowing the investigation of DNA in chromatin context should be performed to demonstrate biological relevance. Our results deepen the knowledge about isoform specific regulation of ECE-1b and -1c in brain tumours. Although first publications hint to proliferation inhibitory effects of ECE-1 antagonists, more studies are required before the pathophysiological significance of ECE-1 in brain tumours can be assessed with certainty.