Die Bedeutung von Annexin A2 bei der Translokation des Wasserkanals Aquaporin 2 im Sammelrohr der Niere

Abstract

Eine Hauptaufgabe der Niere ist die Regulation des Wasser-Salz-Haushaltes. Bei Wassermangel oder Hypernatriämie wird Vasopressin (AVP) ausgeschüttet. Es aktiviert V2-Rezeptoren und stimuliert dadurch die Konzentration des Urins in der Niere. Im Sammelrohr bewirkt die V2-Rezeptor-Signalkaskade eine erhöhte Expression und Translokation des Wasserkanals Aquaporin2 (AQP2) zur apikalen Plasmamembran. Über diesen Kanal wird Wasser aus dem Primärharn in das Interstitium rückresorbiert, um dann wieder den Blutgefäßen zugeführt zu werden. Störungen im AVP-System können sowohl Hypo- als auch Hypernatriämien verursachen. Brattleboro Ratten mit zentralem Diabetes insipidus werden verbreitet als Modellorganismus zur Untersuchung der V2-Rezeptor-Signalkaskade genutzt. Ihre Sammelrohrzellen besitzen zwar den zellulären Signaltransduktionsapparat für die AVP-vermittelte Translokation von AQP2, aufgrund ihres systemischen AVP-Mangels zeigen sie jedoch eine verminderte Expression von AQP2 an der apikalen Plasmamembran und 10-fach erhöhte Urinvolumina. Die hier vorliegende Arbeit belegt eine direkte und spezifische Rolle des kalziumabhängigen Phosholipidbindeproteins ANXA2 und seines Bindungspartners P11 bei der Translokation von AQP2. Dabei liefert sie eine umfassende Lokalisationsstudie von ANXA2 in der Niere. Nach Aktivierung der V2 -Rezeptor-Signalkaskade durch das AVP-Analogon dDAVP zeigt sie neben der Expressionssteigerung von AQP2 auch die erhöhte Expression von ANXA2 und liefert den ersten tierexperimentellen Nachweis der Ko-Translokation von AQP2, ANXA2 und P11. Sie bestätigt und verifiziert die Komplexierung von ANXA2 und AQP2, zeigt aber keine direkte Bindung zwischen den beiden Proteinen. Mittels Peptid SPOT Arrays belegt sie jedoch eine direkte Bindung zwischen P11 und dem C-Terminus von AQP2 und zeigte eine zusätzliche, direkte Bindung zwischen einem Tetramer, bestehend aus zwei ANXA2 und zwei P11 Molekülen, mit dem N-Terminus von AQP2. Diese Bindung ist abhängig vom Phosphostatus des ANXA2. Phosphomimetisches Aspartat anstelle von Serin 26 verhindert die Bindung, wobei phosphomimetisches Aspartat anstelle von Tyrosin 24 keinen Einfluss darauf hat. Die Ergebnisse dieser Studie liefern neue Bausteine zur Entschlüsselung der AVP-Signalkaskade, die im Zuge der Urinkonzentrierung aktiviert wird. Sie ist ein weiterer Schritt zur Entwicklung neuer Therapieansätze zur besseren Behandlung von AVP-induzierten Osmolaritätsstörungen.

A major function of the kidney is the regulation of body water and electrolyte balance. In case of water deprivation or hypernatremia, vasopressin (AVP) is secreted to activate V2 receptors, and therefore stimulates the urinary concentrating mechanism in the kidney. The V2 receptor signaling cascade in the collecting duct leads to increased expression and translocation of the water channel AQP2 (aquaporin2) to the apical membrane. Water from inside the tubular system is reabsorbed by this channel to be delivered back to the vasculature. A disrupted AVP system leads to hyponatremia or hypernatremia. Brattelboro rats are broadly used as a model organism for the analysis of the V2 receptor signaling cascade. Though their collecting duct cells own the signaling transduction machine due to a mutation, they are not able to secrete AVP. Therefore, they show a reduced AQP2 expression at the apical membrane and tenfold increased urine volumes. This dissertation reveals a direct and specific role of the calcium and phospholipid binding protein ANXA2 and its binding partner P11 in the translocation process of AQP2. It provides a widespread localization study of ANXA2 in the kidney. During activation of the V2 receptor signaling cascade via AVP analogon dDAVP it shows not only increased expressions of AQP2 but also of ANXA2. For the first time it proves the co-translocation of AQP2 ANXA2 and P11 in an animal model, under these circumstances. It also confirms the complexation of ANXA2 and AQP2 but does not find direct binding properties. However, using Peptide SPOT Arrays it demonstrates direct linkage among P11 and the C-terminal end of AQP2 and also an additional linkage among a tetramer composed of two ANXA2 and two P11 molecules and the N-terminal end of AQP2. This linkage is dependent on the phosphorylation status of ANXA2. A phosphomimicking aspartate residue at the position of serine 26 prevents the binding, whereas a phosphomimicking aspartate residue at the position of tyrosine 24 does not interfere. These results extend our knowledge regarding the intracellular signaling cascade involved in AVP-mediated urine concentration and may facilitate the development of novel mechanism-based pharmacological tools for the treatment of AVP-related diseases.