Genetische Analyse des LMNA-Gens, kodierend für Lamin A/C, bei Patienten mit Hypertropher Kardiomyopathie und Non-Compaction Kardiomyopathie

Abstract

Kardiomyopathien sind eine sehr heterogene Gruppe von Herzmuskelerkrankungen mit pathologischen funktionellen und strukturellen Veränderungen des Herzmuskels, die ohne den Einfluss einer Koronaren Herzkrankheit, Hypertonie, Herzklappenerkrankungen oder kongenitalen Herzfehlern entstehen. Die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist mit einer Prävalenz von 1:500 die häufigste genetisch bedingte kardiovaskuläre Erkrankung und die häufigste Ursache für einen plötzlichen Herztod unter 35 Jahren. Sie ist charakterisiert durch eine meist asymmetrische Hypertrophie des Myokards, vor allem im Bereich des Septums und des linken Ventrikels. Bisher konnten in über 20 Genen zahlreiche Mutationen identifiziert werden, wobei ungefähr 70 % in den Genen MYH7 und MYBPC3 liegen, welche für die Sarkomerproteine β-Myosin schwere Kette und Myosin-bindendes Protein C kodieren. Die Linksventrikuläre Non-Compaction Kardiomyopathie (LVNC) ist eine weitaus seltenere Kardiomyopathie. Sie zeichnet sich durch die typische zweischichte Optik, bestehend aus einerkompaktierten epikardialen- und einer nicht-kompaktierten endokardialen Schicht, aus. Die Pathogenese der LVNC ist weit weniger erforscht, jedoch wird in mindestens 50 % der Fälle von einem genetischen Ursprung ausgegangen. Das LMNA-Gen, eines der häufigsten Krankheitsgene für familiäre Dilatative Kardiomyopathie (fDCM), stand im Mittelpunkt unserer Untersuchungen. Es umfasst zwölf kodierende Exons, welche für die Proteine Lamin A/C kodieren. Diese gehören zu den Intermediärfilamenten Typ V und bilden zusammen mit anderen Proteinen die Kernlamina, ein dichtes Netzwerk unter der inneren Kernmembran. Lamin A/C sind wichtig für die Stabilität des Zellkerns, haben Einfluss auf Zellproliferation und -differenzierung und übernehmen wichtige Funktionen innerhalb verschiedener Zellvorgänge. Da es auch andere Krankheitsgene mit pleiotropen Effekten bezüglich des myokardialen Phänotyps gibt, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Frage: „Gibt es genetische Varianten im Lamin A/C-Gen bei Patienten mit HCM oder LVNC?“. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchten wir alle zwölf kodierenden Exons von LMNA in drei verschiedenen Patientenkollektiven, einem HCM-Kollektiv mit Ausschluss von Mutation in den bisher bekannten HCM-Genen (K1), einem nicht- selektierten HCM-Kollektiv (K2) und einem LVNC-Kollektiv (K3). Die Patientenrekrutierung und -diagnostik erfolgte mittels Echokardiographie, EKG und Herzkatheterisierung. Die Amplifikation und Sequenzierung der DNA erfolgte durch genetische Standardmethoden. In allen Kollektiven konnten zahlreiche bekannte und unbekannte synonyme Single Nucleotide Polymorphism nachgewiesen werden. Interessanterweise konnten in K1 (72 Patienten) zwei bis dato unbekannte nicht-synonyme heterozygote Missense-Mutationen in zwei nichtverwandten Patienten identifiziert werden. Die Variante c.1322C>T in Exon 7 führt zur Substitution von Alanin gegen Valin im Kodon 441 (p.Ala441Val) und die Variante c.1634G>A in Exon 10 hat den Austausch der Aminosäure Arginin gegen Histidin im Kodon 545 (p.Arg545His) zur Folge. Die betroffenen Aminosäuren sind hochkonserviert in verschiedenen Spezies. Beide liegen in der Ig-like domain, die wichtige Funktionen in der LAP2a- und Emerinbindung übernimmt. Der Ausschluss dieser Mutationen in 300 Kontrollpatienten erfolgte mithilfe eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus. Die betroffenen HCM- Patienten zeigen die typische linksventrikuläre Hypertrophie. Zusätzlich leiden beide an verschiedenen Formen kardialer Arrhythmien. Diese Tatsache ist besonders interessant, da Störungen des Reizleitungssystems typisch für die LMNA-assoziierte fDCM sind. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten LMNA- Mutationen bei Patienten mit HCM beschrieben. Diese Unterstreichen die Annahme, dass es sich bei Kardiomyopathien um echte allelische Erkrankungen handelt. Ob das Vorhandensein von Herzrhythmusstörungen ein spezifisches Merkmal der LMNA-assoziierten HCM ist, gilt es durch Untersuchungen größerer Kohorten herauszufinden. Weiterhin zeigen unsere Ergebnisse einen neuen Aspekt der Vielfältigkeit der Laminopathien. HCM ist demnach die zweite Herzmuskelerkrankung in dieser Gruppe von Erkrankungen.

The aim of the present study was to find new low molecular natural compounds in members of the Convolvulaceae family. The research concentrated on alkaloids which are of particular interest from a pharmacological point of view. The GC-MS analysis was the most important tool in examining the alkaline extracts of the samples taken from almost 50 species of the Convolvulaceae. The results of the GC-MS screening confirmed the extraordinary variety of alkaloid groups in Convolvulaceae: Together with its closely related sister family Solanaceae, the Convolvulaceae are among the richest sources of tropane alkaloids in higher plants. Regarding the pyrrolidine alkaloids, an almost ubiquitous presence was proved in Convolvulaceae. Because of their exclusive presence in Convolvulaceae as the only family of higher plants ergolines can be considered as a family characteristic; however, their distribution is erratic. Pyrrolizidines such as minalobines and ipangulines were confirmed as a common phytochemical feature of the Ipomoea species of the Subgenus Quamoclit Sectio Mina. From Ipomoea cristulata Hallier f. minalobine O was isolated as a new natural compound. The GC-MS analysis of the African species Falkia repens L. f. revealed a plethora of aliphatic and aromatic esters of both epimers of 3-tropanol. For the first time aliphatic tropanol esters were isolated from Convolvulaceae, in particular 3α-acetoxytropane and its N-oxide, 3β-acetoxytropane-N-oxide, 3α-(2’-methylbutyryloxy)tropane, 3β-(2’-methylbutyryloxy)tropane and its N-oxide as well as 3β- tigloyloxytropane-N-oxide, and, in addition, 3β-trans-isoferuloyloxytropane. The new natural compound astrimalvine A-N-oxide and astrimalvine B were isolated from the African Astripomoea malvacea (Klotzsch) Meeuse, the latter substance in its genuine form probably existing as a N-oxide as well. With the isolation of five tropane-N-oxides from Falkia repens and Astripomoea malvacea, the present study provided evidence that tropane alkaloids in Convolvulaceae are accumulated in the form of their N-oxides much more frequently than had been assumed so far. By synthezising so-called Mosher esters, a 1’R-configuration was attributed to consabatine isolated from the Mediterranean Convolvulus sabatius Viv.. The bonabilines from the Madagascan Bonamia spectabilis (Choisy) Hallier f. turned out to be uniquely novel natural compounds due to their acylic moieties which are monoterpenoic acids of the Pinane type. Because of the analogy between the hydroxylation in position 3’ of bonabiline A and the primary hydroxyl moiety of the tropic acid of atropine/hyoscyamine, the antagonistic activity of bonabiline A and its 2’,3’-anhydro derivate bonabiline B was tested on muscarinic M3-receptors. Ipvelutine isolated from the Australian Ipomoea velutina R. Br. was identified as 7β-acetoxy-2α-tigloyloxytropane. Because of its substitution pattern it can be assigned to a group of tropane alkaloids solely detected in Convolvulaceae so far.