Zellbiologische und analytische Untersuchungen zu Lektinen und Triterpenen der Mistel (Viscum album L.)

Abstract

Die Nachfrage nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten für verschiedenste Krebserkrankungen steigt aufgrund der vielfachen Nebenwirkungen der klassischen Therapie stetig an. Wässrige Mistelpräparate (Viscum album L. (Santalaceae)) werden bereits vielfach als komplementäre Behandlungsmethode eingesetzt. Zu den Hauptinhaltsstoffen zählen die Mistellektine, die zu der Gruppe der Ribosomeninaktivierenden Proteine Typ-II gehören und aufgrund ihrer N-Glykosidase-Aktivität das hauptsächlich wirksame zytotoxische Prinzip der Anwendung darstellen. Des Weiteren sind zahlreiche lipophile Substanzen in der Mistel vorhanden, von denen vor allem die Triterpensäuren, hauptsächlich Oleanolsäure, aufgrund ihrer antitumoralen und antiinflammatorischen Eigenschaften von besonderem Interesse sind. Eine Kombination beider Stoffklassen könnte dementsprechend eine Bereicherung auf den Arzneimittelmarkt im Bereich der adjuvanten Tumortherapie sein. Die Quantifizierung der Mistellektine konnte mithilfe zweier etablierter ELISA- Methoden sowohl im wässrigen als auch im serumhaltigen Medium erfolgen. Die Triterpensäuren, vor allem Oleanolsäure, konnten mit einer validierten GC / FID-Methode ebenfalls im lösungsmittel- und im serumhaltigen Milieu bestimmt werden. Der A-Ketten-ELISA ermöglichte zudem die Ermittlung der intrazellulären Mistellektin-Konzentration in Leukämie- und Sarkom-Zellen. Eine Aufnahme von Mistellektinen wurde in jeder kultivierten Tumorzelllinie detektiert. Bei der Osteosarkomzelllinie 143B konnte jedoch eine Mistellektin- Aufnahme erst durch den Zusatz des Triterpensäure-haltigen Extraktes nachgewiesen werden. Eine unterschiedliche Konzentration an Oleanolsäure spielte bezüglich der Mistellektinaufnahme jedoch keine Rolle. Die kombinierte Gabe der hydrophilen und lipophilen Stoffgruppen wurde durch den Zusatz von 2-Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin ermöglicht, der für die Solubilisierung der stark lipophilen Triterpensäuren verantwortlich ist. Eine methanolische Lösung des Triterpensäuren-Extraktes lieferte das gleiche Ergebnis wie der solubilisierte Triterpensäure-Extrakt. Die Formulierung als Liposomen (verkapselter Triterpenextrakt) ermöglichte zwar auch eine Aufnahme der Mistellektine, die aber deutlich geringer ausfiel als der Effekt des in Methanol gelösten bzw. mit 2-Hydroxypropyl- β-Cyclodextrin solubilisierten Triterpensäure-Extrakts. Die Formulierung von Mistellektinen in Liposomen bewirkte eine geringere Aufnahme durch die kultivierten Tumorzellen, die allerdings rezeptor-unabhängig verläuft. Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass bei der Gabe des wässrigen Viscum-Extraktes ein höherer Anteil an Mistellektin aufgenommen wurde als bei der Gabe des Mistellektin-Standards. Bei den Untersuchungen bezüglich der Zytotoxizität konnte mithilfe sowohl eines Endpunktassays als auch einer Echtzeitanalyse mittels Impedanzmessung der wässrige Viscum-Extrakt als toxischer eingestuft werden als der Mistellektin-Standard. Die jeweiligen Kombinationen mit dem Triterpensäure- haltigen Extrakt führten jedoch schließlich zu keiner signifikant erhöhten Zytotoxizität, verglichen mit den Einzelkomponenten. Die Verkapselungen der Einzelkomponenten waren ebenfalls nicht stärker zytotoxisch. Mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wurde der Verlauf von fluoreszenzmarkiertem Mistellektin-Standard innerhalb der Zelle verdeutlicht, die Lokalisation in Endosomen, Vesikelverschmelzungen und Bläschenbildung in der Zelle wurden beobachtet. Die Lyse von Vesikeln durch den Zusatz von triterpensäurehaltigen Extrakten konnte punktuell hervorgerufen und beobachtet werden.

Complementary treatment possibilities for cancer diseases are increasing in demand due to the severe side effects of the standard first-line therapy. A common approach as a complementary treatment is the use of aqueous extracts of Viscum album L. (Santalaceae). The therapeutic activity of the extracts is attributed to the N-glycosidase-activity of the mistletoe lectins which are ribosome-inactivating proteins type II. Besides these constituents, the spectrum of Viscum album L. comprises also a mixture of lipophilic ingredients, mainly triterpene acids, like oleanolic acid which have antitumor and antiinflammatory effects. The combined application of both substance classes could be an enrichment for the adjuvant chemotherapy. The mistletoe lectins could be quantified by two ELISAs in aqueous and in serum containing media. A validated GC / FID-method was used to quantify the triterpene acids, especially oleanolic acid, in organic solvents and also in serum containing media. The intracellular uptake of the mistletoe lectin by leukemia and sarcoma cell lines was analyzed by the A-chain-ELISA. The uptake of mistletoe lectins was determined in all cultured tumor cells. For the 143B osteosarcoma cell line, only the addition of triterpene acids resulted in a measurable intracellular mistletoe lectin concentration. The examination of the impact of the triterpene acid concentration (calculated as oleanolic acid) on the uptake of mistletoe lectin has shown no higher uptake with increasing triterpene acid concentration. The combined application of the hydrophilic and lipophilic substance classes becomes feasible by solubilization of the triterpene acids using 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. The addition of a nonsolubilized lipophilic extract (without 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin) resulted in the same intracellular mistletoe lectin concentration. The modeling as liposomes was enabled a smaller mistletoe lectin uptake than by using the triterpene acid containing extract in methanol or with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. The uptake of mistletoe lectin I from liposomes was also limited. Furthermore, the mistletoe lectin uptake from the viscum extracts by the cells was higher than the uptake of the isolated mistletoe lectin. The examinations of the cytotoxicity using endpoint determinations and real-time analysis has also shown a higher toxicity of the viscum extracts in comparison to the mistletoe lectin standard. The addition of the triterpene acid containing extract or the application as liposomes did not significantly enhance the cytotoxixity. Using confocal laser scanning microscopy, the intracellular transport of fluorescence labeled mistletoe lectin could be analyzed. Vesiculations, localization in endosomes and fusions of vesicles were recognized. The lysis of vesicles could be selectively observed after addition of triterpene acids.