How do proteins control cofactor function?: A Multifrequency Time Resolved ESR study of modified Photosystem I complexes

Abstract

The breakthrough of a Photosystem I (PS I) structure at 2.5Å resolution in 2001 was a key achievement of research teams within the Berlin collaborative research center (Sfb 498). It initiated intense structure-based design and interpretation of spectroscopic work as exemplified in this thesis. This work is devoted to the determination of essential protein-cofactor interactions responsible for the control of cofactor function. In addition, the role of the two C2-symmetric electron transfer (ET) branches from the primary acceptor P700 via the symmetrically located phylloquinones (A1) to the stromal iron- sulphur centers (FeS) is addressed. Systematic modifications of the cofactor- protein interactions are introduced in two ways: firstly substitution of the native cofactor either chemically or via biosynthetic pathway mutants, secondly controlled changes of the protein environment via deletion or site- directed mutants. As direct observables the sequential radical pair intermediates P700+A1-FeS and P700+A1FeS- are used as they occur during light induced charge separation. Their spectral and kinetic properties are determined by a variety of advanced Time Resolved Electron Paramagnetic Resonance (TR-EPR) techniques. Complementary information from optical spectroscopy is considered as well. The combined results from PS I samples with a series of artificial quinones and from site-directed mutants reveal that all essential structural and functional characteristics like location and orientation of the quinone, details of protein-cofactor interactions and mechanistic details remain largely conserved in spite of major changes of either the cofactor itself or its protein environment. The results with substituted 1,4-naphthoquinones (NQ) demonstrate: i) a wide variety of quinones, including those native to type II RC, can function in PS I at the characteristic highly reducing (negative) redox potential; ii) neither the phytyl-tail nor the methyl group in the quinone molecule are necessary for maintaining the essential native quinone characteristics in PS I; however, at least one asymmetric substituent between the C=O groups is necessary; iii) a single saturated alkyl tail (n= 2) as NQ substituent assumes a ring position different from the native phytyl and otherwise unsaturated side chain. A highly asymmetric spin density distribution is identified and mapped over the quinone ring by selective isotope 2H and 13C labeling. It indicates a single and fairly strong hydrogen bond between the quinone and the protein. This protein-quinone interaction remains largely unaffected by any of the changes introduced, just PsaA mutations (Trp to Phe W697FPsaA, Ser to Cys S692CPsaA, Arg to Ala R694APsaA) show systematic weak changes as demonstrated by pulsed Electron Nuclear Double Resonance (ENDOR). The single H-bond to the stroma- faced C=O group of A1 as modeled in the ground state structure is thus confirmed for the functional P700+A1- state and proven to be a highly stable protein cofactor interaction under all modifications studied. Detailed comparisons of protein-cofactor interaction in PS I and the bacterial reaction center are presented and possible reasons for the unusual strength of the hydrogen bond in PS I are discussed. A comprehensive study of eight specific site-directed mutants in the putative ET pathway from P700 through A0 and A1 to FX confirms that the EPR detectable functional charge-separated P700+A1- state is associated with the PsaA branch. In particular, the Met to Leu mutants concerning the A0 ligand show a high PsaA specificity. Only the PsaA mutant (M688LPsaA) results in a major decrease in P700+A1- quantum yield accompanied by 3P700 formation as product of P700+A0- recombination. In contrast, TR-EPR fails to detect any differences between the symmetric M668LPsaB mutant and the wild type. TR-EPR detects a considerable lengthening of the ?slow? ET kinetic phase (A1- to FX) specifically for the PsaA mutants (W697FPsaA, S692CPsaA); however, by the same amount for both mutants R694APsaA and R674APsaB. EPR detected ET-kinetics, their mutation induced changes and temperature dependence are in excellent agreement with those observed for the ?slow? optical phase of the A1 reoxidation kinetics. The existence of a minor ?fast? phase (10-30 ns) is confirmed by complementary optical studies of the same samples. However, in EPR neither direct nor indirect evidence could be obtained although specifically suited TR-EPR experiments have been employed. Our results point towards a clear asymmetry in ET pathways, consistent with forward ET predominantly along the PsaA branch in cyanobacterial PS I. The same kinetics for both Arg to Ala mutants (R694APsaA and R674APsaB) represent a special case, because those mutations influence the kinetically relevant FX properties in a fully symmetric way. All results are combined in a general discussion chapter and subjected to a critical review in the context of related published material.

Mit der Photosystem I (PS I) Struktur bei 2.5Å Auflösung (2001) war den beteiligten Teilprojekten im Berliner Sonderforschungsbereich Sfb 498 ein entscheidender Durchbruch gelungen. Struktur-basierte Planung und Interpretation von Spektroskopie-Experimenten waren damit möglich, wofür diese Doktorarbeit ein Beispiel gibt. Ziel der Arbeit ist die Charakterisierung von Protein-Kofaktor Wechselwirkungen, welche die Kofaktor-Funktion kontrollieren. Außerdem wird die Frage nach der Rolle der beiden C2-symmetrischen Elektrontransfer(ET)-Äste vom primären Donor P700 über die symmetrisch angeordneten Chinone (A1) zu den stroma-seitigen Eisen-Schwefel Zentren aufgegriffen. Systematische Modifizierungen von Protein-Kofaktor Wechselwirkungen werden auf zwei Weisen vorgenommen: erstens Substitution des nativen Kofaktors entweder chemisch oder über Mutanten des Biosyntheseweges, zweitens kontrollierte Veränderungen der Proteinumgebung durch ?deletion-? und Punkt-Mutanten. Als Beobachtungssonde werden aufeinander folgende Radikalpaare P700+A1-FeS und P700+A1FeS- genutzt, wie sie im Verlauf der lichtinduzierten Ladungstrennung im Reaktionzentum (RZ) entstehen. Ihre spektralen und kinetischen Eigenschaften werden mit der Methode der zeitauflösenden Elektronenspin-Resonanz Spektroskopie (TR-EPR) bestimmt. Komplementäre Information von optischer Spektroskopie wird ebenfalls einbezogen. Ingesamt zeigen die Ergebnisse an PS I - Proben mit einer Serie von künstlichen Chinonen und von Punkt-Mutanten, dass alle wesentlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften, wie Lage und Orientierung des Chinons, Details der Protein-Kofaktor- Wechselwirkungen und mechanistische Details weitgehend erhalten bleiben, trotz erheblicher Änderungen am Kofaktor selbst bzw. in seiner Proteinumgebung. Die Ergebnisse mit substituierten 1,4-Naphtochinonen (NQ) zeigen: i) eine Vielfalt von Chinonen einschließlich solcher, die für Typ II RZ nativ vorkommen, kann in PS I die Funktion von A1 übernehmen, und dies bei dem für Typ I RZ stark reduzierenden (negativen) Redoxpotential; ii) weder der Phytyl- noch der Methyl-Rest der Chinon Moleküle ist für die Beibehaltung der Chinon-Eigenschaften von Wildtyp PS I erforderlich, jedoch ist mindestens ein asymmetrischer Substituent zwischen den C=O Gruppen notwendig; iii) ein einzelner gesättigter Alkyl-Rest als NQ-Substituent nimmt die zum nativen Phytyl-Schwanz oder zu anderen ungesättigten Seitenketten entgegen gesetzte Ringposition ein. Eine stark asymmetrische Spindichteverteilung in dem Chinon- Ring wird mit der Hilfe von gezielter 2H- und 13C- Isotopenmarkierung abgesichert und einer einzelnen, starken H-Brücke zwischen Chinon und Protein zugeordnet. Diese Protein-Chinon Wechselwirkung bleibt nahe unbeeinflusst von jeder der eingeführten Veränderungen; lediglich die PsaA Mutanten (Trp zu Phe W697FPsaA, Ser zu Cys S692CPsaA, Arg zu Ala R694APsaA) zeigen kleine systematische Änderungen der Chinon-Hyperfeinstruktur die mit der Hilfe der gepulsten Elektron-Kern-Doppel-Resonanz ausgemessen wurden. Die einzelne H-Brücke zu der Stroma-seitigen Chinon C=O Gruppe, wie sie in der Grundzustandsstruktur identifiziert ist, wird hier für den funktionellen P700+A1- Zustand bestätigt und erweist sich als eine besonders stabile Protein-Kofaktor Wechselwirkung gegenüber allen hier getesteten Modifizierungen. Die Protein-Kofaktor Wechselwirkung in Typ I (PS I) und Typ II (bRZ) Reaktionzentren werden verglichen und mögliche Gründe für die ungewöhnlich starke H-Brücke diskutiert. Die Untersuchung von acht Punkt- Mutanten im mutmaßlichen ET-Weg von P700 über A0 und A1 bis FX stellt sicher, dass der EPR-detektierbare, funktionelle ladungsgetrennte P700+A1- Zustand zu QK im PsaA-Ast gehören. Speziell die Met zu Leu Mutanten, die den Liganden zum A0 Kofaktor betreffen, zeigen eine hohe PsaA-Spezifizität. Nur die PsaA- Mutante (M688LPsaA) führt zu einer starken Verringerung der (P700+A1 -)-Quanten-Ausbeute, verbunden mit der Bildung eines 3P700 Triplett- Rekombinationsproduktes aus dem P700+A0- Zustand. Im Gegensatz dazu werden keine Unterschiede zwischen M668LPsaB und WT festgestellt. TR-EPR findet eine beträchtliche Verlängerung der sog. ?langsamen? optischen Phase in der A1- Reoxidationskinetik, speziell für die PsaA Mutanten (W697FPsaA, S692CPsaA); dagegen wird Verlängerung um den gleichen Faktor sowohl für die PsaA Mutante (R694APsaA) als auch für PsaB Mutante (R674APsaB) beobachtet. Die EPR- detektierten ET-Kinetiken, ihre Mutations-bedingten Veränderungen und die Temperaturabhängigkeiten sind mit den Ergebnissen für die optisch beobachtete ?langsame? kinetische Phase der A1- Reoxidation in ausgezeichneter Übereinstimmung. Die Existenz einer ?schnellen? Phase (10-30 ns) ist für die gleichen Proben in einer komplementären optischen Untersuchung bestätigt worden. Dagegen konnte mit EPR weder direkte noch indirekte Evidenz für einen signifikanten Beitrag der schnelle Phase gefunden werden, obwohl besonders geeignete TR-EPR Techniken zum Einsatz kamen. Diese Ergebnisse weisen daher klar auf eine Asymmetrie im Vorwärts ET hin, wobei in Cyanobakterien der PsaA- Ast bevorzugt ist. Die identische Kinetik für beide Arg zu Ala Mutanten (R694APsaA und R674APsaB) stellt einen besonderen Fall dar, denn bei diesen Mutanten werden die kinetisch relevanten FX- Eigenschaften in völlig symmetrischer Weise beeinflusst. Alle Ergebnisse werden in einem Kapitel ?General Discussion? einander gegenüber gestellt und einer kritischen Durchsicht im Zusammenhang mit anderen Ergebnisse in der Literatur unterzogen.