Functional characterization of GYF-domain containing proteins

Abstract

GYF-domains (standing for a conserved glycine, tyrosine, phenylalanine motif) are small adapter domains that interact with proline-rich sequences (PRS) of other proteins. Two subfamilies have been described so far that both differ in the binding behavior of the respective GYF-domain. The CD2BP2-type subfamily is named after the first GYF protein discovered, the CD2 binding protein 2. This protein was found as binding partner of the T cell adhesion molecule CD2. Independent work showed an involvement of CD2BP2 in nuclear mRNA splicing. The Smy2-type subfamily is named after the yeast suppressor of myosin 2-66. The human and mouse ortholog of Smy2 is called Grb-10 interacting GYF protein 2 (GIGYF2). Here, very little was known about the function at the beginning of this study. The aim of this study was to characterize the two proteins GIGYF2 and CD2BP2 in different cell lines and mouse organs for a better understanding of their functional implications within the cell. Also, a conditional CD2BP2 knockout (KO) mouse was generated to primarily address the question of whether or not mice can survive without CD2BP2. Expression analyses by a newly generated antibody against the GIGYF2 GYF-domain were performed to show the specificity of the antibody. The localization of GIGYF2 was addressed with nuclear and cytoplasmic extracts of human HeLa and rat pc12 cells, showing a cytoplasmic localization of the protein. GIGYF2 showed a ubiquitous protein expression in different mouse organs of C57BL/6 (BL6) mice with the least amounts in the kidney. Novel potential interaction partners suggested by pull- down in combination with SILAC-MS analyses were confirmed by immunofluorescence co-localization studies. Analyses in HeLa cells and the neuronal cell lines SH-SY5Y and Neuro2a showed the localization of GIGYF2 to the ER and Golgi in living cells and its co-localization with the COPII vesicle component Sec31 in fixed cells. Also, GIGYF2 was stress-dependently recruited into cytoplasmic stress granules (SGs), where it co-localized with the SG marker TIA-1. A stress-dependent co-localization with TIA-1 could also be observed in neurites of SH-SY5Y cells. Expression analyses of CD2BP2 in mouse organs showed a ubiquitous expression at the mRNA level whereas it was mainly expressed in hematopoietic organs at the protein level. A more detailed analysis in immune cells revealed the presence of CD2BP2 in mature B and T cells, dendritic cells and macrophages. Studies in developing T cells showed the expression of CD2BP2 at double negative stage 1 (DN1) and subsequent stages. For the generation of a conditional CD2BP2 KO mouse, a targeting vector was cloned and electroporated into 129 and BL6 strain derived murine stem cells (ES cells). Positive clones were injected into morulae and implanted into foster mothers. Only 129-derived ES cell clones gave rise to high chimeric offspring. Germline transmitted founder mice were bred with PGK- Cre deleter mice for the induction of the KO. Breedings of CD2BP2+/- mice resulted in no homozygous KO. Analysis of timed matings showed embryonic lethality of CD2BP2 null mice before embryonic day 10.5. From this study, we strongly favor the hypothesis that GIGYF2 is involved in the assembly or regulation of ribonuculear protein complexes. Future studies should focus on its involvement in the transport of mRNA from the cell soma to neurites within neuronal cells. Mice cannot survive without CD2BP2. The predominant hematopoietic expression in adult mice speaks for a major function in the immune system. Why this gene, which is expressed in all organs at RNA level, is down regulated at the protein level needs to be addressed in future studies. Also, the reason for the lethality during embryonic development will help to understand the function of this GYF-domain containing protein in more detail.

GYF-Domänen, die nach einem konservierten Glycin, Tyrosin, Phenylalanin Motiv benannt sind, sind kleine Adapterdomänen, die mit prolinreichen Sequenzen anderer Proteinen interagieren. Bisher wurden zwei Unterklassen beschrieben, die sich im Bindungsverhalten der GYF-Domäne unterscheiden. Die CD2BP2-Typ Unterfamilie wurde nach dem CD2 bindenden Protein 2 (CD2BP2) benannt, in dem die erste GYF-Domäne identifiziert wurde. CD2BP2 erkennt die zytoplasmatischen prolinreichen Sequenzen des T Zell Adhesionsmoleküls CD2. Weitere Studien zeigten eine Beteiligung von CD2BP2 an splißosomalen Prozessen im Zellkern. Die Smy2-Typ Unterfamilie wurde nach dem Hefeprotein „Suppressor of myosin 2-66“ (Smy2) benannt. Ein zu Smy2 humanes und murines Ortholog ist das „Grb-10 interacting GYF protein 2“ (GIGYF2). Über dieses Protein war zu Beginn dieser Arbeit sehr wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die beiden Proteine CD2BP2 und GIGYF2 in verschiedenen Zelllinien und Organen der Maus im Bezug auf ihre zelluläre Funktion charakterisiert werden. Weiterhin wurde eine konditionelle CD2BP2 Knockout (KO) Maus generiert, um die primäre Frage zu beantworten, ob Mäuse ohne CD2BP2 lebensfähig sind. Die Spezifität eines neu hergestellten Antikörpers gegen die GYF-Domäne von GIGYF2 wurde mittels Expressionsanalysen bewiesen. Für die Untersuchung der zellulären Lokalisation von GIGYF2 wurden nukleare und zytoplasmatische Zellextrakte aus humanen HeLa Zellen und aus Ratten pc12 Zellen eingesetzt. Beide Zelltypen zeigten eine hauptsächlich zyoplasmatische Expression des Proteins. Untersuchungen an Zelllysaten verschiedener C57BL/6 (BL6) Mausorgane wiesen auf eine ubiquitäre Expression von GIGYF2 in Mausorganen hin. Am geringsten wurde das Protein in der Niere exprimiert. Vorangegangene Pull-down-Experimente in Kombination mit der massenspektrometrischen Analyse der Bindungspartner (SILAC-MS) hatten neue potentielle Interaktionspartner von GIGYF2 hervorgebracht, die mittels Kolokalisationsstudien genauer untersucht wurden. Studien in lebenden HeLa Zellen, den neuronalen Zelllinien SH-SY5Y und Neuro2a zeigten, dass GIGYF2 innerhalb der Zelle im ER und dem Golgi Apparat lokalisiert ist. In fixierten Zellen kolokalisierte GIGYF2 mit dem COPII Vesikel Protein Sec31 und wurde stressinduziert in zytoplasmatische „stress granules“ (SG) rekrutiert. Diese stressinduzierte Kolokalisation mit dem SG Markerprotein TIA-1 wurde auch in Neuriten von SH-SY5Y Zellen beobachtet. CD2BP2 Expressionsanalysen in verschiedenen Mausorganen zeigten eine ubiquitäre Expression auf mRNA Ebene wohingegen CD2BP2 auf Proteinebene hauptsächlich in hämatopoetischen Organen gefunden wurde. Eine detaillierte Expressionsanalyse in Immunzellen detektierte CD2BP2 in reifen B und T Zellen, Dendritischen Zellen und Makrophagen. In unreifen T Zellen wurde CD2BP2 schon im frühesten Entwicklungsstadium, der doppelt negativen Phase 1, gefunden. Zur Herstellung einer konditionellen CD2BP2 KO Maus wurde ein Zielvektor kloniert, der in murine Stammzellen der Stämme 129 und BL6 elektroporiert wurde. Daraus resultierende positive Klone wurden in Morulae injiziert und in Leihmütter implantiert. Nur die Stammzellklone des 129er Stamms führten zu hochchimären Mäusen. Mäuse, die den Zielvektor durch Keimbahntransmission in ihrem Genom integriert hatten, wurden für die Induktion des KO mit PGK-Cre Mäusen verpaart. Die Verpaarung von CD2BP2+/- Mäusen erbrachte keine homozygoten CD2BP2 KO Mäuse. Bei zeitlich kontrollierten Verpaarungen starben CD2BP2 KO Mäuse vor dem Embryonaltag 10,5. Die Ergebnissen dieser Studie legen nahe, dass GIGYF2 in die Assemblierung oder Regulation von ribonuklären Proteinkomplexen involviert ist. In zukünftigen Studien sollte weiterhin die Funktion von GIGYF2 bei dem neuronalen Transport von mRNA vom Zellsoma in Neuriten untersucht werden. Für Mäuse ist CD2BP2 offensichtlich ein essentielles Gen. Die hauptsächliche Expression von CD2BP2 in hämatopoetischen Organen adulter Mäuse spricht für eine späte Hauptfunktion im Immunsystem. Der Grund für die unterschiedliche Expression von CD2BP2 auf mRNA und Protein Ebene muß in zukünftigen Studien untersucht werden. Der Grund für die embryonale Letalität des GYF-Domänen Proteins CD2BP2 sollte helfen, wichtige, an dieses Protein gekoppelte Prozesse innerhalb des Organismus genauer zu verstehen.