In vitro Untersuchungen zum Einfluss des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxib auf humane Osteoblasten

Abstract

Steffen Lach, Timo Gaber-Elsner, Rene Dziurla, Robert Tripmacher, Dörte Krocker, Georg Matziolis, Carsten Perka, Gerd-Rüdiger Burmester, Frank Buttgereit. Med. Klinik m. S. Rheumatologie & Klin. Immun. und Zentrum für Muskuloskeletale Chirurgie, Charité und DRFZ, 10117 Berlin, Deutschland

Celecoxib ist ein wichtiger Vertreter selektiver COX-2-Inhibitoren. Dabei handelt es sich um eine potente antiinflammatorische und analgetische Substanz, die zur Behandlung von Erkrankungen des Bewegungsapparates, wie der rheumatoiden Arthritis oder der Osteoarthritis, eingesetzt wird. Mit Hilfe eines in vitro Systems sollte der Einfluss von Celecoxib auf die Zellvitalität, den Knochenstoffwechsel und den Energiemetabolismus humaner Osteoblasten näher untersucht werden. Es wurden sowohl Zellen der humanen Osteosarkomzelllinie MG-63 als auch primäre humane Osteoblasten verwendet und mit Celecoxibkonzentrationen von 10 µM und 50 µM inkubiert. Die Vitalitätsbestimmungen erfolgten mikroskopisch mit der Trypanblau- Ausschlussfärbung. Als ein bedeutendes Zytokin im Knochenstoffwechsel wurde Osteoprotegerin (OPG), welches knochenabbauende Prozesse verhindert, auf Transkriptionsebene (Realtime-PCR) und Proteinebene (ELISA) bestimmt. Die Wirkungen von Celecoxib auf den Energiemetabolismus der humanen Osteoblasten wurden beschrieben durch die Messung der Effekte auf den Glukosetransporter GLUT-1 (Realtime-PCR), den Sauerstoffverbrauch (Clark-Elektrode) und das Regulatorprotein HIF-1a (Westernblot). Celecoxib verursachte eine zeit- und konzentrationsabhängige Abnahme der Zellvitalität. 6 % der Zellen, die mit Celecoxib 50 µM inkubiert wurden, waren nach 24 Stunden nicht mehr vital. Dagegen bewirkte Celecoxib 10 µM nach 24 Stunden Inkubation nur einen Anteil von etwa 1,5 % avitalen Zellen. Celecoxib 10 µM rief weder in MG-63 Osteoblasten noch in primären humanen Osteoblasten eine messbare Expressionsveränderung von OPG auf Transkriptions- und Proteinebene im Inkubationszeitraum hervor. Dagegen führte Celecoxib 50 µM bei den primären humanen Osteoblasten zu einer 2,2fachen und bei den MG-63 Osteoblasten zu einer 3,6fachen, jeweils signifikanten, Reduzierung der OPG-mRNA-Expression nach 24 Stunden. Auf Proteinebene kam es bei den primären humanen Osteoblasten zu einer signifikanten (1,6fachen) Abnahme der OPG-Sekretion. Die Sauerstoffverbrauchsmessungen zeigten keine Soforteffekte nach Applikation von Celecoxib 10 µM. Nach 24 Stunden war jedoch eine etwa 20 %ige Erhöhung der zellulären Atmung eingetreten. Celecoxib 50 µM steigerte schon unmittelbar nach Zugabe den Sauerstoffverbrauch der Zellen signifikant um 21 %. Nach 24 Stunden zeigte sich ein um 32 % signifikant gesteigerter Sauerstoffverbrauch. Die Hypothese, dass diese Effekte durch eine Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung hervorgerufen werden, bestätigte sich durch parallele Untersuchungen mit dem Protonophore FCCP. Dem erhöhten Sauerstoffverbrauch der Zellen folgte konsekutiv die verstärkte mRNA-Expression des Glukosetransporters GLUT-1, was ebenfalls zeit- und konzentrationsabhängig war. Nach 24stündiger Inkubation mit Celecoxib 10 µM nahm die mRNA-Expression von GLUT-1 um den Faktor 2 zu; Celecoxib 50 µM bewirkte sogar eine 24fache Steigerung. Die Expression von HIF-1a war zu keinem Inkubationszeitpunkt messbar, was den Nachweis normoxischer Zustände während der Inkubation reflektierte. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit geht hervor, dass Celecoxib neben der bekannten selektiven Hemmung der COX-2 auch andere Effekte, u. a. auf den zellulären Energie- und Knochenstoffwechsel und die Zellproliferation, hat. Diese Effekte treten jedoch nur bei sehr hohen Celecoxibkonzentrationen (50 µM) auf, die im klinischen Alltag bisher noch nicht erreicht wurden. Unter Berücksichtigung klinisch relevanter Celecoxibdosierungen sollten die Effekte unter Konzentrationen von 10 µM im Fokus weiterer Untersuchungen stehen. Diese Studie wurde durch Pfizer unterstützt.

Steffen Lach, Timo Gaber-Elsner, Rene Dziurla, Robert Tripmacher, Dörte Krocker, Georg Matziolis, Carsten Perka, Gerd-Rüdiger Burmester, Frank Buttgereit. Med. Klinik m. S. Rheumatologie & Klin. Immun. und Zentrum für Muskuloskeletale Chirurgie, Charité und DRFZ, 10117 Berlin, Germany

Background: The selective COX-2 inhibitor celecoxib is widely used for the symptomatic treatment of pain and inflammation in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. The drug has well-known and important effects on immune cells, but its direct and/or indirect influence on bone cells such as osteoblasts has not been explored in detail yet.

Objective: The aim of this study was, therefore, to investigate the dose- dependent effects of celecoxib on cell proliferation (viability), bone remodelling processes (OPG) and energy metabolism (GLUT-1, oxygen consumption, HIF-1?) in cultured human osteoblastic cells.

Methods: Primary human osteoblasts (phOB) and MG-63 cells (immortalized osteosarcoma cell line) were cultured in BSA-free medium and incubated with different concentrations of celecoxib (10 µM, 50 µM) for 2, 6 and 24 h, respectively. Measurements of cell viability were determined by trypan blue exclusion method. The mRNA expressions of OPG and GLUT-1 were measured by quantitative real time PCR analysis. OPG protein secretion was determined from culture supernatants by ELISA technique. Effects on cellular oxygen consumption were amperometrically measured using a Clark electrode. HIF-1? protein expression was analysed by immunoblotting. Results: The cell viability was significantly reduced by celecoxib after 24 h (growth inhibition: 6 % at 50 µM, 1.5 % at 10 µM, respectively, p<0.05). We found celecoxib at suprapharmacological concentrations (50 µM) to inhibit significantly OPG mRNA expression in phOB and in MG-63 cells (2.2-fold and 3.6-fold, respectively) as well as OPG protein secretion (1.6-fold in phOB after 24 h). In contrast, celecoxib 10 µM did not have any measurable effects on OPG levels during this incubation period. In MG-63 cells, celecoxib at 50 µM was found to stimulate significantly oxygen consumption by 21 % (0 h; p<0.05) and by 32 % (24 h; p<0.05), respectively. This effect is very likely due to mitochondrial uncoupling as concluded from corresponding experiments with the protonophor FCCP. Celecoxib also enhanced the GLUT-1 mRNA expression in MG-63 cells in a time and dose dependent manner by 2-fold at 10 µM and by 24-fold at 50 µM after 24 h, respectively. HIF-1? protein was not expressed at any conditions within our experimental setting.

Conclusion: Distinct effects of celecoxib on cell viability (reduction), OPG expression (inhibition), oxygen consumption (stimulation) and GLUT-1 mRNA expression (stimulation) in osteoblastic cells were only observed at 50 µM which is a concentration not reached by therapeutic dosages where plasma concentrations are lower than 10 µM. However, higher intracellular concentrations due to accumulation processes might occur. Therefore, the clinical relevance of the observed effects of celecoxib at 10 µM needs to be further explored.

The study was supported by Pfizer.