The endocytic adaptor stonin 1 regulates cell signalling and focal adhesion dynamics

Abstract

Endocytosis determines the number and localisation of cell surface receptors thereby regulating recognition of environmental cues and cell signalling cascades. General endocytic adaptors like the adaptor protein 2 (AP2) recognise most cell surface receptors destined for internalisation via clathrin-mediated endocytosis. In contrast, cargo recognition by specific endocytic adaptors convey specificity for distinct cargos to allow fine tuning of processes ranging from neurotransmission to cellular motility. The stonin (Stn) protein family comprises two homologues representing such specialised endocytic adaptors. Stn2 has been described in detail to regulate neurotransmission by facilitating the uptake of the synaptic vesicle protein synaptotagmin 1. In contrast, Stn1 modulates cell motility by controlling the surface levels of neuron glial 2 (NG2). However, the molecular details and physiological importance of Stn1 function remained unresolved. In the present study, we demonstrate that Stn1 acts as a tumour suppressor and describe two distinct Stn1 functions which might contribute to tumour development. First, we establish that Stn1 as a specialised endocytic adaptor for the oncogene NG2 regulates cellular signalling which might have implications during cancer development. Using biochemical approaches, we show that Stn1 interacts with the cytosolic domain of NG2 via its μ-homology domain and that Stn1 links NG2 with the endocytic machinery. Since endocytic adaptors regulate the surface levels of their cargos, absence of the adaptors often leads to accumulation of the cargo on the cell surface. In fact, immunohistological stainings performed on mouse brains demonstrated that in absence of Stn1 NG2 levels are increased in the olfactory bulb of young animals. NG2 is a well-known oncogene that stimulates cell signalling as well as cell adhesion and directional cell migration. Therefore, elevated NG2 levels in Stn1-depleted cells suggest an increased functionality of the cell surface receptor. Accordingly, we show that the elevated NG2 levels of Stn1-depleted cells correlate with enhanced signalling via the platelet-derived growth factor β - a signalling cascade that is regulated via NG2 to modulate tumour neovascularisation. The results therefore suggest that Stn1, by limiting the surface levels of its cargo NG2, acts as tumour suppressor. In fact, analysis of the molecular signature of human glioblastoma via public databases revealed that an increased Stn1 expression correlates with a prolonged survival of the patients. Vice versa, induction of glioblastoma in Stn1-depleted mice amplified the tumour growth. Besides cell signalling also cell movements via focal adhesions plays a central role for tumour growth. Using cell biological approaches we demonstrate that Stn1 facilitates focal adhesion dynamics by accelerating focal adhesion disassembly. Consequently, this effect potentially contributes to an increased protrusion and trailing end stability in absence of Stn1 thereby promoting directional migration. In addition, we provide evidence that Stn1 controls focal adhesion maturation via the actin cytoskeleton. The specific interaction with the actin- depolymerisation factor Destrin indicates a collaborative action of both proteins within that context. Taken together our results establish Stn1 as an important regulator of NG2-dependent signalling and cell migration. Since both processes play central roles during tumour development, this work deepens the current understanding of this serious disease.

Endozytose bestimmt die Anzahl und Lokalisation von Oberflächenrezeptoren und reguliert damit die Erkennung von Signalen des nahen Umfeldes sowie deren Signalgebung. Allgemeine endozytische Erkennungsmotive erkennen die meisten Zelloberflächenrezeptoren, wohingegen spezielle endozytische Adaptoren Spezifität für bestimmte Frachten vermitteln und somit Prozesse wie Neurotransmission und Zellbewegung genau abstimmen können. Die Stonin (Stn) Proteinfamilie umfasst zwei Homologe, die solch spezialisierte endozytische Adaptoren darstellen. Für Stn2 wurde bereits detailliert beschrieben, auf welche Weise es Neurotransmission durch die Aufnahme des synaptischen Proteins Synaptotagmin 1 beschleunigt. Stn1 hingegen steuert die Zellbewegung, indem es die Oberflächenlevel des Neuronen-Glia Antigen 2 (NG2) kontrolliert. Allerdings sind die molekularen Details und die physiologische Bedeutung dieser Stn1-Funktion im Unklaren geblieben. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass Stn1 als Tumorsuppressor fungiert und beschreiben zwei distinkte Stn1-Funktionen, die dazu beitragen. Als Erstes begründen wir den Fakt, dass Stn1 der endozytische Adaptor für das Onkogen NG2 ist und darüber die Signalgebung in der Zelle beeinflusst, was potentiell Bedeutung für die Ausbildung von Tumoren haben könnte. Hierfür zeigen wir mit Hilfe von biochemischen Methoden, dass die μ-homologe Domäne von Stn1 mit der zytosolischen Domäne von NG2 interagiert und seine Fracht NG2 mit dem allgemeinen endozytischen Adaptor AP2 verknüpft. Da endozytische Adaptoren die Oberflächenlevel ihrer Fracht regulieren, resultiert ein Fehlen dieser Adaptoren oftmals in einer Akkumulation der Fracht an der Zelloberfläche. Tatsächlich zeigen wir in immunhistologischen Färbungen von Mausgehirnen, dass ohne die Anwesenheit von Stn1 die Proteinlevel seiner Fracht NG2 im Riechkolben von Jungtieren erhöht sind. NG2 ist ein allgemein bekanntes Onkogen, das die Signalgebung von Zellen ebenso stimuliert wie die Zelladhäsion und damit verbundene Zellmigration. Erhöhte NG2-Proteinlevel in Zellen, in denen Stn1 dezimiert wurde, weisen somit auf eine verstärkte Funktionalität des Oberflächenrezeptors hin. Entsprechend weisen wir in Stn1-depletierten Zellen, die erhöhte NG2-Proteinlevel aufweisen, eine verstärkte Signalgebung des Rezeptors für Blutplättchen- extrahierte Wachstumsfaktoren des Typs β nach. Dies ist eine Signalkaskade, die von NG2 maßgeblich beeinflusst wird, um die Neovaskularisierung - unter anderem von Tumoren - zu stimulieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Stn1, indem es die Oberflächenlevel seiner Fracht NG2 limitiert, eine Tumor-supprimierende Wirkung aufweisen könnte. Tatsächlich korreliert eine erhöhte Stn1-Expression mit einer längeren Überlebenswahrscheinlichkeit von Gliomapatienten. Im Gegensatz dazu weisen induzierte Glioblastomen in Stn1-depletierten Mäusen ein verstärktes Wachstum auf. Neben der Signalgebung spielt die Zellfortbewegung via fokaler Adhäsionen eine zentrale Rolle beim Tumorwachstum. Mit Hilfe von zellbiologischen Experimenten weisen wir nach, dass Stn1 die Dynamiken der fokalen Adhäsionen beschleunigt, indem es deren Disassemblierung fördert. Dementsprechend trägt dieser Effekt potentiell zu einer erhöhten Stabilität der Zellfront sowie des Zellschwanzes in Stn1-depletierten Zellen bei und unterstützt damit deren direktionale Fortbewegung. Zusätzlich deuten erste Ergebnisse darauf hin, dass Stn1 die Reifung von fokalen Adhäsionen über das Aktinzytoskelett kontrolliert. Die Interaktion mit dem Aktin- depolymerisierenden Faktor Destrin deutet auf eine Zusammenarbeit beider Proteine in diesem Kontext hin. Zusammenfassend etablieren unsere Ergebnisse Stn1 als einen wichtigen Regulator der Zellfortbewegung und NG2-abhängigen Signalgebung. Da beide Prozesse bei der Entwicklung von Tumoren eine zentrale Rolle spielen, vertieft diese Studie das derzeitige Verständnis dieser schwerwiegenden Krankheit.