Genexpression humaner Panethzellen bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen: Untersuchung antimikrobieller Peptide, des Wnt-Signalweges und von NALP- Proteinen

Abstract

Panethzellen sind Zylinderepithelzellen, die sich durch die charakteristische Lage (ortho-top) in der Tiefe der Lieberkühnkrypten des Dünndarms, insbesondere des terminalen Ileums und die Produktion und Sekretion antimikrobieller Peptide (HDEFA5 und HDEFA6, PLA2, SLPI u.a.) auszeichnen. Aufgrund der Zellprodukte wird den Panethzellen eine wichtige Rolle in der intestinalen Immunabwehr zugeschrieben. Bereits in früheren Arbeiten wurde das Auftreten von Panethzellen außerhalb des Dünndarms (metaplastisch), ins- besondere bei entzündlichen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, beschrieben. Außerdem zeigten Untersuchungen an orthotopen Panethzellen eine veränderte Expression der antimikrobiellen Peptide bei CED. Ausgehend von diesen bereits bekannten Untersuchungen erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit zunächst die immunhistologische Detektion metaplastischer Panethzellen im Colon ascendens bei M. Crohn und Colitis ulcerosa aus Paraffin- eingebetteten Gewebeproben. Nach Separierung der metaplastischen PC durch die lasergestützte Mikrodissektion und Bildung der Untersuchungsgruppen (MC, CU, PC Ileum, Kontrolle) erfolgte die Genexpressionsanalyse dieser Zellen. Die immunhis-tologischen Untersuchungen mit dem Selektionsmarker HDEFA6 zeigten bei 66,7% der Patienten mit M. Crohn, bei 64,1% der Patienten mit Colitis ulcerosa und bei 0% der Kont-rollgruppe metaplastische Panethzellen im Colon ascendens. Die detektierten metaplasti-schen Panethzellen wiesen keine morphologischen Veränderungen im Vergleich zu den orthotopen Panethzellen des Dünndarms auf. Die Expressionsanalyse panethzellspezifi-scher Gene ergab eine signifikant erniedrigte Expression von HDEFA5 und HDEFA6 in orthotopen Panethzellen, sowie eine signifikante Überexpression von HDEFA5 und 6 bei Colitis ulcerosa und M. Crohn. Unterschiede zeigten sich auch zwischen den metaplasti-schen Panethzellen, die HDEFA5 und HDEFA6-Expression ist bei M. Crohn im Vergleich zu metaplastischen Panethzellen bei Colitis ulcerosa signifikant erniedrigt. Die panethzellspezifischen Marker PLA2 und SLPI zeigten eine signifikante Überexpression in orthotopen Panethzellen, waren jedoch in den metaplastischen Panethzellen herunter reguliert. Die Expressionsanalyse extrazellulärer Wnt-Gene ergab bis auf Ausnahme des WNT10B eine signifikant verminderte Expression in orthotopen Panethzellen. Die Wnt- Proteine WNT3, WNT3A, WNT6, WNT7B, WNT8 zeigen eine Überexpression in metaplastischen Panethzellen bei M. Crohn und Colitis ulcerosa im Vergleich zu orthotopen Panethzellen. WNT1, WNT9B und WNT10B scheinen signifikant vermindert exprimiert bei Colitis ulcerosa. Die Expressionsanalyse der intrazellulären Wnt-Gene ergab eine Überexpression von β-Catenin in den orthotopen Panethzellen. Es zeigten sich keine signifikanten Expressionsunterschiede von β-Catenin zwischen den metaplastischen Panethzellen. TCF4 zeigte sich sowohl in den orthotopen Panethzellen als auch in den metaplastischen Panethzellen bei M. Crohn mit signifikant erhöhter Expression, während die TCF1-Expression in metaplastischen Panethzellen bei M. Crohn deutlich herunter reguliert war. Das Frizzled5-Gen zeigte eine signifikante Überexpression in den metaplastischen Panethzellen. Der Wnt- Antagonist WIF1 zeigte eine signifikant verminderte Expression in orthotopen Panethzellen und metaplastischen Panethzellen bei Colitis ulcerosa und ein signifikante Überexpression in metaplastischen Pa-nethzellen bei M. Crohn. Die SFRP2-Expression, ebenfalls ein Wnt-Antagonist, zeigte eine Überexpression in orthotopen Panethzellen und keine signifikanten Unterschiede in den metaplastischen Panethzellen. Die Genexpressionanalyse der NALP-Proteine zeigte eine signifikant verminderte Expression von NALP 1, 5, 6, 7, 8, 12 in orthotopen Panethzellen. Weiterhin bestand eine deutliche Überexpression von NALP1 und NALP7 in metaplastischen Panethzellen bei CED. NALP11 wurde von metaplastischen Panethzellen bei M. Crohn signifikant vermindert exprimiert. Die Expression von NALP2, 5, 6, 12 zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den metaplastischen Panethzellen und den orthotopen Panethzellen. Die Genexpressionsanalyse von NALP 3, 4, 9, 10, 13 und 14 ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den untersuchten Zellpools. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse die antimikrobielle Funktion der Paneth-zellen, in normalem sowie in entzündetem Gewebe und weisen gleichermaßen auf einen inaktivierten Zustand der orthotopen Panethzellen hin. Die Ergebnisse des Wnt-Signalweges unterstreichen die regulatorische Funktion der Panethzellen für die Aktivie-rung im inflammatorischen Zustand, was sich direkt auf den Differenzierungsgrad der Panethzellen auswirkt. Weiterhin scheint aufgrund der Ergebnisse eine Beteiligung der NALP-Proteine an der Pathogenese von CED wahrscheinlich. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass bestimmte Gene in den metaplastischen Panethzellen bei M. Crohn und Colitis ulcerosa unterschiedlich reguliert sind. Das unterstützt die Vorstellung einer multifaktoriellen Genese dieser Erkrankungen. Zusammengefasst können die Ergeb-nisse dieser Arbeit als Grundlage für weiterführende Untersuchungen dienen.

Paneth cells are intestinal epithelial cells, located in the Lieberkühn crypts of the terminal ileum. They characteristically produce antimicrobial peptides (HDEFA5 and HDEFA6, PLA2, SLPI), so they may play a significant role in intestinal immunity. Recent studies describe metaplastic Paneth cells in ascending colon in patients with inflammatory bowel disease. Further investigations of orthotopic Paneth cells have shown different expression of antimicrobial peptides in IBD. First we performed immunhistological staining of paraffine embedded tissue of ascending colon to detect metaplastic Paneth cells in patients with Crohn`s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Metaplastic Paneth cells were isolated by using Laser-assisted microdissection. Gene expression analysis was performed of three composed pools of Paneth cells (CD, UC, orthotopic Paneth cells ileum) and control. The immunhistochemical staining showed an increased amount of metaplastic Paneth cells in 64% of the patients with ulcerative colitis (n=39), and in 67% of the patients with Crohn's disease (n=36). In the control group of 39 patients, we could not detect any Paneth cells in the non inflamed colon ascendens. Metaplastic Paneth cells were found in all IBD specimens in the base of the Lieberkühn crypt. Morphologically, there was no difference in the typically granulated cytoplasm and basal position of the nucleus. Microarray analysis showed decreased expression of HDEFA5 and HDEFA6 in orthotopic Paneth cells and a remarkable increased expression of HDEFA5 and HDEFA6 in CD and UC. Furthermore there were differences in HDEFA5 and HDEFA6- expression of metaplastic Paneth cells. Paneth cells of CD patients showed a decreased HDEFA5 and HDEFA6- expression compared with UC patients. Microarray analysis of specifically Paneth cell markers PLA2 and SLPI has shown overexpression in orthotopic Paneth cells and downregulation in metaplastic Paneth cells. Wnt expression analysis showed decreased expression of extacellular Wnt-genes in orthotopic Paneth cells, except WNT10B. WNT3, WNT3A, WNT6, WNT7B and WNT8 were overexpressed in metaplastic Paneth cells in CD and UC compared to orthotopic Paneth cells. WNT1, WNT9B and WNT10B were downregulated in UC. Wnt expression analysis of intracellular Wnt-genes showed increased expression of β-Catenin in orthotopic Paneth cells. There were no significant differences of β-Catenin expression in metaplastic Paneth cells. The TCF4 expression analysis was increased in orthotopic Paneth cells and metaplastic Paneth cells in CD compared to human adult colonic mRNA. TCF1 expression seemed to be downregulated in metaplastic Paneth cells in CD. Frizzled5 expression was increased in metaplastic Paneth cells. WIF1, presumed to be a Wnt antagonist, showed a decreased expression in orthotopic Paneth cells and metaplastic Paneth cells of UC specimen. Furthermore WIF1 expression showed an overexpression in metaplastic Paneth cells of CD specimen. SFRP2, presumed to be a Wnt antagonist as well, showed an overexpression in orthotopic Paneth cells and there were no differences detected in metaplastic Paneth cells. Microarray analysis of NALP proteins showed a significant downregulation of NALP 1, 5, 6, 7, 8, 12 in orthotopic Paneth cells. Furthermore our data showed an obvious overexpression of NALP1 and NALP7 in metaplastic Paneth cells in IBD. NALP11 expression was downregulated in metaplastic Paneth cells of CD specimen. There were no differences detected in expression of NALP2, 5, 6, 12 in metaplastic and orthotopic Paneth cells. Gene expression analysis of NALP 3, 4, 9, 10, 13 and 14 showed no differences between examined samples as well. Finally, analysis results confirm the antimicrobial activity of orthotopic and metaplastic Paneth cells. Furthermore our results reveal an inactive mode of orthotopic Paneth cells. The results of Wnt signaling pathway underline the regulatory role of Paneth cells in an inflammatory condition. That might have an influence on the degree of Paneth cell differentiation. NALP expression analysis make an involvement of NALPs likely in pathogenesis of IBD. This study has shown a variable regulation of certain genes of metaplastic Paneth cells in patients with CD and UC. These findings support the proposition of a multifactorial genesis of IBD.