Neurotrophe Eigenschaften der Endometriose

Abstract

Zu den Leitsymptomen der Endometriose gehören Schmerzsymptome wie Dysmenorrhoe, Dyspareunie und chronische Unterbauchschmerzen. Die Frage nach dem Mechanismus der Schmerzentstehung ist bei dieser Erkrankung jedoch nach wie vor nicht vollständig zu beantworten. Ziel der Untersuchungen war es, die histomorphologischen Beziehungen zwischen peritonealen Endometrioseläsionen und den umliegenden Nervenfasern zu untersuchen. Zudem sollten diese Nervenfasern bezüglich ihrer Qualität charakterisiert werden. Um eine Aussage über den Reifegrad dieser Nervenfasern zu treffen, sollten die Vaskularisation und die Expression von Nervenwachstumsmarkern untersucht werden. Die Expression von Nervenwachstumsmarkern, als potenzielle Botenstoffe für eine funktionelle Interaktion zwischen Endometriosezellen und Nervenzellen, sollte zusätzlich im Endometriosegewebe und in Endometriosezellkulturen untersucht werden. Zudem war es Ziel der Untersuchungen, ein In-vitro-Modell zur Interaktionsanalyse zwischen Endometriose- und Nervenzellen zu etablieren. 106 peritoneale Endometrioseläsionen von 73 Patientinnen wurden immunhistochemisch mit Antikörpern gegen Neurofilament, einem Marker für Nervenfasern, Substanz P, einem Markermolekül für sensible Nerven, Nerve Growth Factor, einem Nervenwachstumsfaktor, Neurotrophin 3, einem weiteren Nervenwachstumsfaktor, und Growth Associated Protein 43, einem Nervenwachstumsmarker, untersucht. Zusätzlich wurde eine Dreifachfärbung gegen Neurofilament, von-Willebrand- Faktor und Smooth Muscle Actin durchgeführt. Primäre Endometriosezellkulturen wurden per Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Nerve Growth Factor gefärbt. Western-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um die Anwesenheit von Nerve Growth Factor in primären Zellkulturen von Endometrioseläsionen, in der Douglasflüssigkeit von Endometriosepatientinnen, in Endometriosegewebe und den Konditionierten Versuchsmedien von primären Endometriosezellkulturen nachzuweisen. Um die Wechselwirkungen zwischen Nerven und dem von Endometriosezellen produzierten Nerve Growth Factor zu untersuchen, wurden im Neuronal Growth Assay Hinterwurzelganglien von Hühnerembryonen in von Endometriosezellen Konditioniertem Versuchsmedium kultiviert. Bei 56 von 73 Patientinnen (76,7 %) konnten Nervenfasern mit Kontakt zur Endometrioseläsion (<1,5 mm) oder direkt im Stroma der Endometrioseläsion gezeigt werden. Alle untersuchten Schnitte wiesen Nervenfasern im Stroma von peritonealen Endometrioseläsionen mit Substanz P positiven Anteilen auf. Mithilfe der Dreifachfärbung zeigte sich, dass die Nervenfasern im Stroma der peritonealen Endometrioseläsionen ausschließlich von unreifen Gefäßen begleitet werden. Außerdem exprimieren diese Nervenfasern das Growth Associated Protein 43. Alle untersuchten Endometrioseherde weisen eine mittlere bis starke Nerve-Growth- Factor-Expression und eine schwache bis mittlere Neurotrophin-3-Expression auf. Mithilfe der Western-Blot-Analyse konnte der Nerve Growth Factor in den primären Zellkulturen von Endometrioseläsionen, in der Douglasflüssigkeit von Endometriosepatientinnen, im Endometriosegewebe und in den Konditionierten Versuchsmedien von primären Endometriosezellkulturen nachgewiesen werden. Im Neuronal Growth Assay induzierte das Konditionierte Versuchsmedium das Aussprossen der Ganglien so, wie es auch durch die Zugabe von exogenem Nerve Growth Factor ausgelöst wird. In dieser Untersuchung konnten Nervenfasern im Stroma und in der Nähe von peritonealen Endometrioseläsionen nachgewiesen werden. Außerdem konnte bewiesen werden, dass diese Nervenfasern sensible Anteile mit sich führen. Da diese Nervenfasern von unreifen Gefäßen begleitet werden und Nervenwachstumsmarker exprimieren, konnte gezeigt werden, dass diese Nervenfasern neu entstanden sind. In diesen Untersuchungen konnte zudem erstmals gezeigt werden, dass nicht nur peritoneale Endometrioseläsionen, sondern auch primäre Endometriosezellkulturen den Nerve Growth Factor exprimieren und dass Hinterwurzelganglien von Hühnerembryonen in von Endometriosezellen Konditionierten Versuchsmedien aussprossen. Diese Ergebnisse belegen, dass Endometriosezellen neurotrophe Eigenschaften, also einen stimulierenden Effekt auf das Nervenzellwachstum, besitzen. Es ist anzunehmen, dass diese neurotrophen Eigenschaften zur Pathogenese von Endometriose assoziierten Unterbauchschmerzen beitragen. Das Neuronal Growth Assay kann nun Basis für weitere Interaktionsuntersuchungen sein, um die Ätiologie der Schmerzentstehung bei Endometriosepatientinnen besser zu verstehen.

Endometriosis is often associated with pelvic pain, however the role of endometriosis in the aetiology of chronic pelvic pain is still unclear. The aim of this study is to evaluate the histological relationship between endometriotic lesions and pain-conducting nerve fibers and to determine the maturation status of the nerve fibers and the accompanying blood vessels. Another aim was to investigate the possible role of endometriotic cell- produced neurotrophic factors to promote growth of peritoneal nerve fibers towards the endometriotic lesions. Immunohistochemistry with primary antibodies against neurofilament (NF) was performed on 106 peritoneal endometriotic lesions of 73 patients with symptomatic endometriosis and the peritoneum of 9 patients without endometriosis. Nerve-fiber quality was examined by immunohistochemical double stainig against NF and substance P (Sub P), present in sensory nerve fibers. The maturation of endometriotic vascularization and the vascularisation of the surrounding nerve fiber was examined by triple stainig with antibodies against NF, smooth muscle actin (smActin) and von Willebrand factor (vWF), whereby immature blood vessels are characterized by the expression of vWF-positive endothelial cells without surrounding smActin-positive smooth muscle cells. Growth-associated protein 43 (GAP-43) was used as a marker molecule for neurite outgrowth and regeneration. Immunohistochemical analysis was used to evaluate the expression of the established neurotrophic factors nerve growth factor (NGF) and neurotophin-3 (NT-3). Western-blot-analysis was used to confirm the presence of NGF in primary culture cells from patients with endometriosis and in the peritoneal fluid obtained from patients with endometriosis. To investigate the interactions between nerve fibers and endometriotic cell-produced NGF, embryonic dorsal root ganglion neurons (DRG) were cultured in endometriosis conditioned medium (neuronal-growth-assay). Nerve fibers were found in the stroma or close (<1,5 mm) to the endometriotic lesions in 56 patients (76,7%). In all examined sections Sub P-expressing nerve fibers were present. Most nerve fibers in or near endometriotic stromal cells were colocalized with immature blood vessels. Moderate to strong GAP-43 expression could be identified in endometriosis-associated nerve fibers. All endometriotic lesion expressed NGF and NT-3 moderately to strongly. NGF was also immunodetected in primary culture cells from patients with endometriosis and in the peritoneal fluid of endometriosis patients, in endometriosis tissue and in the conditioned medium from endometriosis cell cultures. The conditioned medium induced an increase of neurite outgrowth similar to the neurite outgrowth induced by exogenously added NGF. This study provides the evidence for the presence of nerve fibers located in the stroma of peritoneal endometriotic lesions. We could also identify these nerve fibers as sensory nerve fibers. Endometriosis-associated nerve fibers are accompanied by immature blood vessels within the stroma. This study shows that GAP-43 is expressed in endometriosis-associated nerve fibers. This implies that the nerves detected are newly formed. This study also shows that not only peritoneal endometriotic lesions but also primary endometriosis cell cultures express Nerve Growth Factor. The results of the neuronal-growth-assay demonstrate a stimulating effect of ectopic endometrial glands and stroma to the growth of nerve fibers. It can be assumed that the neurotrophic activity of the endometriotic lesions plays an important role in the aetiology of pelvic pain associated with peritoneal endometriosis. The Neuronal Growth Assay can now be used for further investigation in order to better understand the aetiology of pelvic pain associated with peritoneal endometriosis.