Kinase pathways involved in the vasopressin signaling along the distal nephron: roles of SPAK and OSR1 kinases

Abstract

The Na+-K+-2Cl--cotransporter (NKCC2) of thick ascending limb (TAL) and the Na+-Cl--cotransporter (NCC) of distal convoluted tubule (DCT) are critical for renal salt handling. The two cotransporters have an important role in maintaining extracellular volume and blood pressure. Principally, activity of the two closely related transporters is determined by their luminal trafficking and phosphorylation. These processes can be modulated by endocrine stimuli. Recent studies have clarified V2-receptor mediated effects of vasopressin (AVP; antidiuretic hormone) in the distal nephron, leading to increased salt reabsorption along with the stimulation of water transport in the collecting duct. With-no-lysine [K]) kinases (WNK) have been recognized as a part of this signaling pathway. The catalytic effects of WNKs are typically mediated by other downstream kinases, among which the two homologous Ste20-like kinases SPAK and OSR1 are important because of their ability to directly phosphorylate NKCC2 and NCC at their conserved N-terminal threonine- and serine residues. This work was aimed at a segment-specific elucidation of the roles of SPAK and OSR1 in mediating the effects of AVP in TAL and DCT. SPAK-deletion in mice was associated with increased NKCC2 but decreased NCC phosphorylation, indicating a segment-specific role of the kinase in the regulation of these transporters. OSR1, although largely co-expressed with SPAK, failed to compensate for SPAK deficiency, suggesting non-redundant roles for the two kinases. A novel, kidney-specific SPAK splice variant (KS-SPAK) with a truncated kinase-domain and dominant-negative properties was identified. In controls, KS-SPAK was predominantly distributed in TAL, where it inhibited OSR1 and full-length SPAK (FL-SPAK) in a competitive manner. KS- SPAK hereby caused the deactivation of NKCC2. In contrast, FL-SPAK was predominantly expressed in DCT, providing NCC phosphorylation. AVP-deficient Brattleboro-rats with central diabetes insipidus were used as models for extrinsic AVP-stimulation. Acute AVP-administration stimulated NKCC2 and NCC by increasing its trafficking and phosphorylation. In DCT, FL-SPAK was identified as a key component of AVP-signaling; this refers to acute and chronic effects of this hormone as well. In TAL, SPAK and OSR1 were both involved in mediating the effects of AVP. Additionally, expression of KS-SPAK was reduced upon AVP. These data have revealed new aspects of the WNK- SPAK/OSR1-NKCC2/NCC cascade, characterizing SPAK and OSR1 as the major kinases in AVP-induced activation of the distal salt transporters. Data extend information on the physiology of urine concentration and the regulation of salt excretion. SPAK and OSR1 will thus be a potential focus for targets to targeting water- and electrolyte homeostasis.

Der Na+-K+-2Cl--Kotransporter (NKCC2) im dicken aufsteigenden Teil der Henle- Schleife (TAL) und der Na+-Cl-- Kotransporter (NCC) im distalen Konvolut (DCT) sind entscheidend an der Regulation der renalen Salzausscheidung beteiligt. Somit spielen die beiden Transporter eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des extrazellulären Volumens und des Blutdrucks. Die Aktivität der Transporter wird durch Trafficking und Phosphorylierung bestimmt. Diese Vorgänge können endokrin moduliert werden. Es war bekannt, dass das antidiuretische Hormon (ADH, Vasopressin) neben seiner Wirkung auf den Wassertransport im Sammelrohr auch den distalen Salztransport über seinen V2 Rezeptor stimulieren kann. With-no-lysin [K]-Kinasen (WNK) waren als Teil des Signalwegs zu Transportern identifiziert. Ihre katalytische Wirkung aktiviert weitere Kinasen, zu denen die homologen, Ste20-ähnlichen SPAK und OSR1 rechnen. Vorarbeiten zeigten, dass diese wiederum die zwei Kotransporter an ihren N-terminalen Threonin- bzw. Serinresten phosphorylieren und somit aktivieren können. Ziel der vorliegenden Arbeit waren die segmentspezifische Charakterisierung der beiden Kinasen und ihre Rolle bei der Vermittlung ADH- induzierter Stimuli jeweils in TAL und DCT. Mithilfe von SPAK-/- Mäusen konnten wir zeigen, dass trotz der Koexpression von SPAK und OSR1 entlang dem distalen Nephron segmentspezifische, nicht-redundante Rollen von OSR1 und SPAK für die Regulation von NKCC2 bzw. NCC identifizierbar waren; die NKCC2-Phosphorylierung war hier stark erhöht, die von NCC jedoch deutlich reduziert. In einem kooperativen Ansatz konnten wir diesen verwirrenden Phänotyp aufklären. Eine nierenspezifische SPAK-Spleißvariante mit trunzierter Kinase-Domäne und dominant-negativen Eigenschaften (kidney-specific [KS]-SPAK) wurde identifiziert. In Kontrollen war KS-SPAK funktionell hauptsächlich im TAL belegbar und hemmte hier kompetitiv OSR1 sowie die aktive full-length SPAK Form (FL-SPAK); KS-SPAK bewirkt hierdurch offenbar auch eine Deaktivierung von NKCC2. Im Gegensatz dazu war die Aktivierung von NCC kritisch von der reichlich im DCT exprimierten FL-SPAK abhängig. ADH-defiziente Brattleboro- Ratten mit zentralem Diabetes Insipidus (DI) wurden als Modell für extrinsische ADH-Stimulation eingesetzt. Akute ADH-Gabe stimulierte sowohl NKCC2 wie auch NCC durch deren gesteigerte Oberflächenexpression und Phosphorylierung. Im DCT wurde FL-SPAK hierbei als Schlüsselkomponente der ADH-Signaltransduktion identifiziert; dies betraf sowohl die akuten als auch die chronischen Effekte des Hormons. Im TAL waren SPAK und OSR1 unter ADH gleichermaßen aktiviert, zusätzlich war die inhibitorische KS-SPAK quantitativ reduziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen neue Aspekte der Funktion des WNK-SPAK/OSR1-NKCC2/NCC Signalnetzwerks im distalen Nephron und charakterisieren die Phosphokinase SPAK neben OSR1 als ein wichtiges Zwischenglied der ADH-induzierten Transportaktivierung. Die vorgestellten Daten liefern neue Aspekte zur Physiologie der Harnkonzentrierung und zur Regulation der NaCl-Ausscheidung. In der Perspektive rücken die Kinasen SPAK und OSR1 in den Vordergrund therapeutischer Beeinflussungsmöglichkeiten von Wasser- und Elektrolythomöostase.